MÉTODO DE TITULACIÓN IN VITRO DE UN ATNC Y SU APLICACIÓN EN UN MÉTODO DE EVALUACIÓN Y/O CONTROL DE UN PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE UN PRODUCTO BIOLÓGICO.

Método de titulación in vitro de un ATNC y su aplicación en un método de evaluación y/o control de un procedimiento de obtención de un producto biológico. [0001] La presente invención se refiere a un método de titulación in vitro de un agente transmisible no convencional (ATNC) que utiliza líneas celulares transgénicas, su aplicación a un método de evaluación y/o control in vitro de la eficacia de un procedimiento de obtención o tratamiento de un producto biológico o de una o varias etapas de dicho procedimiento para la eliminación de un ATNC y su aplicación a un método de evaluación y/o control in vitro de un procedimiento de descontaminación. [0002] Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) reagrupan un conjunto de enfermedades genéticas o adquiridas caracterizadas por una degeneración del sistema nervioso central (SNC), que en el hombre se conocen como, entre otras, enfermedad de Creutzfeld-Jacob (ECJ) y que también afectan a numerosos mamíferos, particularmente ovinos y bovinos (tembladera ovina y encefalopatía espongiforme bovina). Las propiedades del agente etiológico de estas enfermedades la clasifican en lo que llamamos "agentes transmisibles no convencionales" (ATNC). El agente causal no se conoce. Pero el sello de la enfermedad es la presencia de una proteína extracelular, llamada proteína prión (PrP), que, durante la enfermedad, adopta una forma insoluble, resistente a las proteasas tales como la proteinasa K, y que se acumula en las células, provocando la muerte de ellas. Esta forma anormal patógena de la PrP, llamada PrPsc, proviene de una modificación de la conformación de la proteína prión PrP. No se evidenció modificación de la expresión del gen que codifica para la PrP, ni alteración de su traducción (P. Brown, Transfusion, 41, 4333-436, 2001 y D. Vôlkel et al, Transfusion, 41, 441-448, 2001). [0003] La transgénesis in vitro o in vivo contribuye ampliamente al conocimiento de las EST. De este modo, los ratones cuyo gen codifica para la PrPsc fue inactivado son muy resistentes a la infección experimental. En cambio, los ratones y cultivos celulares que expresan (o sobreexpresan) transgenes patológicos, clonados a partir del gen de la PrP de individuos que padecen EST familiar, o xenógenos, reproducen las enfermedades hereditarias correspondientes o son sensibles a un inóculo proveniente de individuos infectados que pertenece a la misma especie que los transgenes. Las líneas celulares transgénicas también se utilizan como modelo in vitro para buscar moléculas que interactúen con la transconformación de la PrP en PrPsc. [0004] Los datos disponibles en la actualidad no permiten demostrar que el agente transmisible responsable de las EET se encuentre en una forma infecciosa en la sangre y los derivados sanguíneos (ver referencia anterior a P. Brown). No obstante, no podemos concluir que no esté presente, ya que esta incertidumbre resulta, por un lado, de su probable concentración muy baja en la sangre y, por otro, del larguísimo período de incubación de la enfermedad, cuando ya está instalada. [0005] Además, la sorprendente resistencia del ATNC impide recurrir a los procedimientos de inactivación clásicamente aplicados, tales como el tratamiento solvente/detergente Tween-TNBP, que demostraron su eficacia para reducir la carga viral de derivados sanguíneos, tales como las proteínas crioprecipitables del plasma (factor VIII, factor von Willebrand, etc.). De hecho, estos se verían completamente destruidos por los procedimientos conocidos para reducir la infectividad, por ejemplo, en presencia de NaOH 1M. [0006] Dado que la obtención o el tratamiento de productos biológicos, tales como las proteínas plasmáticas de la coagulación, debe incorporar etapas de eliminación/inactivación virales en vistas de un uso terapéutico, la industria farmacéutica de los medicamentos derivados de la sangre busca, actualmente, evaluar el riesgo teórico de transmisión del variante de la ECJ mediante los productos derivados de la sangre. [0007] Por lo tanto, es necesario implementar un método de titulación sensible, específico y rápido, que pueda aplicarse para evaluar el grado de eliminación del ATNC que puede aportar una etapa o una sucesión de etapas aplicadas en el marco de un procedimiento de purificación de productos biológicos o en el marco de un procedimiento de descontaminación de un material, especialmente de un material reutilizable. [0008] Actualmente, el método que suele aplicarse utiliza un método de titulación in vivo con una línea sensible de hámsters dorados, mediante inyección intracerebral de diferentes diluciones de un producto a probar cargado con prión patógeno. Según el número de animales afectados en los diferentes grupos correspondientes a las diluciones efectuadas, se puede calcular un título de infectividad y establecer el cociente de reducción de un procedimiento dado a partir de una referencia no tratada. Sin embargo, este método presenta el inconveniente de ser largo, oneroso y poco compatible con un desarrollo a escala industrial, cuya eficacia con respecto a la eliminación del prión quisiéramos conocer rápidamente. 2   [0009] Sabuncu et al. (Journal of Virology, Feb. 2003, p. 2696-2700) describe la determinación del título de infectividad de extractos celulares infectados mediante titulación al límite in vivo en ratones transgénicos TgOv que expresan el alelo VRQ de la PrP ovina. [0010] Además, suele ser necesario introducir una etapa de concentración del agente infeccioso para aumentar la sensibilidad de los métodos de titulación. Ahora bien, todos los procedimientos de concentración de agentes infecciosos responsables de la EET copurifican PrPsc. [0011] Por otra parte, hay métodos conocidos para la titulación in vitro de los agentes infecciosos de las EET. Consisten en la detección de la PrPsc mediante la técnica de Western-Blot (Ironside J.W. et al, J. of Thrombosis and Haemostasis, 1, 1479-1486, 2003) o de ELISA. Estas técnicas necesitan una digestión previa de la muestra que se analizará por la Proteinasa K, o una desnaturalización mediante agentes caotrópicos para distinguir la proteína patológica (PrPsc) de la proteína normal (PrP). Recientemente, se desarrolló otro método de titulación basado en la utilización de los anticuerpos específicos de la PrPsc que no reconocen la PrP. [0012] Las titulaciones de infectividad ligadas a los ATNC se realizan mediante inoculación intracerebral de animales de laboratorio, por ejemplo roedores que, previamente, permitieron la adaptación de cepas de EET que infectan otras especies animales o ratones transgénicos que expresan una PrP de la misma especie que la fuente de infectividad. [0013] Algunos autores compararon el límite de detección de las técnicas inmunoquímicas de detección de la PrPsc con el de las técnicas in vivo e in vitro (inoculación de cultivos celulares transgénicos), con fines diagnósticos. A modo de ejemplo, se puede mencionar la patente US 6 150 583 en la que se prevén animales transgénicos que expresan la PrP epítope marcada. [0014] En el caso de los virus clásicos, las técnicas de detección de los agentes infecciosos pueden hacerse de manera directa, como la titulación de la infectividad in vitro e in vivo y, de manera indirecta, mediante las etapas de amplificación en cadena por polimerasa de genomas virales, inoculación in vivo seguida de la demostración de seroconversiones respecto a agentes virales caracterizados, y detección inmunoquímica o molecular de marcadores asociados a una patología. [0015] La evaluación de técnicas directas respecto a las técnicas indirectas es un requisito previo a su utilización experimental con fines reglamentarios. De este modo, se distinguen los virus pertinentes cuya titulación de infectividad in vitro es válida (una cepa viral adaptada en una línea celular continua sensible y permisiva), de los virus modelos, más allegados a un agente patógeno cuya propagación in vitro no es reproducible. [0016] Hasta el momento, la validación experimental, respecto de los ATNC, de las etapas de inactivación viral incluidas en procedimientos de obtención o de purificación de productos biológicos o de las etapas de descontaminación de material, sólo puede realizarse de modo directo in vivo mediante inoculación intracerebral, por ejemplo, en roedores de laboratorio o ratones transgénicos o, de modo indirecto in vitro, mediante detección inmunoquímica de la PrPsc. En efecto, no hay ningún ácido nucleico en el material infeccioso, por lo tanto, la RCP no puede utilizarse. Además, la proteína anormal in vivo no provoca la formación de anticuerpos específicos. Por lo tanto, hay que recurrir a anticuerpos monoclonales. [0017] Para paliar los inconvenientes de los métodos anteriores de detección y titulación de los ATNC en productos biológicos,... [Seguir leyendo]

1. Método de titulación in vitro de un agente transmisible no convencional (ATNC) en un producto biológico, en el que las células transgénicas estables que soportan la replicación de dicho ATNC están en contacto con dicho producto biológico y se cultivan durante uno o varios pasajes para amplificar la cantidad de ATNC presente en dicho producto biológico mediante replicación de dicho ATNC. 2. Método de titulación según la reivindicación 1, en el que las células transgénicas estables se cultivan en presencia de al menos una dilución del producto biológico en una solución acuosa biológicamente aceptable. 3. Método de titulación según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ATNC se detecta en cada pasaje. 4. Método de titulación según la reivindicación 3, en el que el ATNC se detecta en cada pasaje mediante un método inmunoquímico. 5. Método de titulación según la reivindicación 4, en el que el ATNC se detecta en cada pasaje mediante Westem-blot. 6. Método de titulación según la reivindicación 5, en el que el título del ATNC se mide aplicando un método estadístico. 7. Método de titulación según la reivindicación 6, en el que el título del ATNC se mide aplicando el método de Spearman-Kärber. 8. Método de titulación según la reivindicación 4, en el que el ATNC se detecta en cada pasaje mediante ELISA. 9. Método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ATNC corresponde a una forma patógena del prión proteína PrPsc. 10. Método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células transgénicas estables son células epiteliales de conejo. 11. Método de titulación según las reivindicaciones 9 y 10, en el que las células transgénicas estables son células epiteliales de conejo de la línea Rov9. 12. Método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células transgénicas estables son células gliales de ratón. 13. Método de titulación según las reivindicaciones 9 y 12, en el que las células transgénicas estables son células gliales de ratón de la línea MovS6. 14. Método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el producto biológico se elige del grupo constituido por los productos sanguíneos y sus derivados, los alimentos, los productos cosméticos y los productos que presentan un riesgo para el medioambiente. 15. Método de evaluación y/o de control in vitro de un procedimiento de obtención o tratamiento de un producto biológico que puede contaminarse con un ATNC, en el que se aplica a dicho producto biológico, antes y después de dicho procedimiento, un método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y se comparan los dos valores de títulos obtenidos. 16. Aplicación de un método de evaluación y/o control según la reivindicación 15 a un procedimiento de purificación de productos sanguíneos y sus derivados. 17. Aplicación según la reivindicación 16, en la que el procedimiento de purificación representa las cromatografías o la nanofiltración. 18. Método de evaluación y/o control in vitro de un procedimiento de descontaminación de un material, en el que el material por descontaminar se pone en contacto con un producto biológico que contiene un ATNC y en el que se aplica, a dicho producto biológico, antes y después de dicho procedimiento, un método de titulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y se comparan los dos valores de título obtenidos.