Método de construcción de un ave transgénica.

Un método para construir un ave transgénica G1 que comprende:

a) incubar un huevo de ave fertilizado,

b) microinyectar en el corazón de su embrión temprano después de la fase blastodérmica, cuando el embrión temprano está al menos 48 horas después del comienzo de la incubación, un vector retroviral de replicación deficiente que contiene un gen obtenido no de retrovirus que codifica un anticuerpo,

c) dejar que el huevo eclosione para obtener, de este modo, un ave quimérica transgénica G0, y

d) aparear a un ave quimérica transgénica G0 macho con un ave hembra de tipo silvestre.

Método de construcción de un ave transgénica.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un método para construir un ave transgénica que es aplicable en la producción de una proteína fisiológicamente activa.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Como resultado de los progresos en la tecnología de recombinación génica, un gran número de proteínas fisiológicamente activas se han producido a nivel comercial para su uso como fármacos y en otros usos. Sin embargo, microorganismos como Escherichia coli que se han usado de la forma más frecuente en la producción de dichas proteínas recombinantes son incapaces de añadirles una cadena glucídica y, por lo tanto, las proteínas producidas no pueden experimentar modificación mediante la adición de cadena glucídica; por lo tanto, de forma desfavorable, muestran descensos de actividad en comparación con su actividad intrínseca y/o muestran deterioros de estabilidad.

Además, los microorganismos no pueden producir proteínas complicadas compuestas por una pluralidad de unidades, por ejemplo anticuerpos. Es una gran desventaja que no pueden utilizarse para producir anticuerpos monoclonales que se usarán como fármacos.

Por lo tanto, aquellas proteínas fisiológicamente activas tales como eritropoyetina y anticuerpos usados como fármacos, que se requiere que tengan una cadena glucídica, se producen actualmente por medio de reactores de células cultivadas. Sin embargo, dichos procesos de producción que usan células animales conllevan mayores costes en comparación con el uso de microorganismos y, por lo tanto, es un problema que se impone una gran carga a los pacientes y a la administración.

Un nuevo método para producir proteínas mientras se superan estas desventajas que ha llamado la atención comprende la utilización de animales transgénicos. Las proteínas producidas en leche, sangre o huevos por animales transgénicos pueden tener una cadena o cadenas glucídicas añadidas y, además, el coste de producción es de un décimo a un centésimo en comparación con el caso del uso de células animales cultivadas (Nature Biotechnology 19, 184, 2001) . Se espera que la transgénica que usa aves, por ejemplo, se lleve a la práctica debido a características ventajosas tales como la brevedad del periodo hasta la madurez y la pequeñez del área de cría.

Aunque la tecnología de producción de proteínas que utiliza aves transgénicas tiene estas y otras ventajas, se han encontrado algunas dificultades para llevar esa tecnología a uso práctico. Una de ellas es la dificultad para introducir un gen extraño en huevos de ave fertilizados (Harvey A. J. et al. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures. Poult. Sci., Feb. 2002, Vol. 81, No. 2, págs. 202-212) . Los inventores de la presente invención tuvieron éxito anteriormente en la construcción de forma eficaz de quimeras transgénicas (denominadas como "G0") que portan un transgén parcialmente en sus cuerpos como resultado de microinyección del gen en embriones tempranos de ave usando un vector viral de replicación deficiente altamente seguro (Publicación "Kokai" de Solicitud de Patente Japonesa 2002-176880) .

Sin embargo, el gen introducido de esta manera experimenta inactivación mediante los mecanismos biofilácticos del huésped (fenómeno llamado silenciación) , no consiguiendo producir la proteína deseada o produciendo la proteína, si ésta se expresa, solamente en cantidades vestigiales. Además, para suministrar la proteína de forma estable como una medicina, es necesario establecer una línea aviar que tiene un transgén en todas las células somáticas del cuerpo como descendencia de la quimera transgénica G0. Esta descendencia de la quimera transgénica G0 se denominan G1, G2, G3 y similares en el orden de generación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En vista del estado de la técnica mencionado anteriormente, es un objeto de la presente invención establecer un método eficaz para construir aves transgénicas que tienen un transgén en todas las células somáticas y capaces de expresar la proteína codificada por el transgén a niveles altos con el fin de aplicar las aves transgénicas como un sistema seguro y eficaz de producción de proteínas.

La invención es un método como se especifica en la reivindicación 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención es un método como se especifica en la reivindicación 1. Cuando se inyecta el vector en el corazón formado de forma temprana en el embrión después del paso de cierto periodo de tiempo especificable dependiendo de las especies aviares, el embrión temprano objetivo de la inyección puede dar un ave transgénica capaz de expresar eficazmente el gen en cuestión.

El gen que se introducirá en un ave para dar un ave transgénica es un gen de anticuerpo.

Cuando se usa una gallina o codorniz como el ave en la cual se va a introducir el gen, la proteína deseada puede obtenerse en los huevos de manera productiva y estable. Realizaciones adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Aunque el locus, en el cromosoma, del gen introducido mediante microinyección no puede especificarse, es posible identificar progenitores G0 capaces de producir eficazmente aves G1 clasificando quimeras de linaje reproductor que tienen el gen insertado en el sistema reproductor de entre las quimeras transgénicas G0 construidas. En dicha clasificación es eficaz un método que comprende recoger esperma de machos G0 mediante masaje abdominal y ensayar el esperma en busca de la aparición del transgén en su interior. Este método de clasificación también constituye un aspecto de la presente descripción.

La invención describe, por lo tanto, un método para construir aves transgénicas ventajoso en la producción de anticuerpos.

El ave transgénica construida mediante dicho método puede utilizarse en la producción de un anticuerpo que pueda utilizarse como un fármaco, y similares.

A continuación, la invención se describe en detalle.

El ave transgénica G1 y/o una cría de la misma es una ave con un gen extraño introducido en su interior por medio de un vector retroviral de replicación deficiente y se caracteriza porque contiene el gen extraño uniformemente en sus células somáticas y expresa la proteína deseada que se origina en el transgén de forma estable en su sangre o en la clara o la yema del huevo.

El ave que se usará en la puesta en práctica de la invención no está particularmente restringida pero pueden mencionarse, por ejemplo, gallinas, pavos, patos, avestruces, codornices y otras aves domésticas y aves de compañía domesticadas con el fin de de carne para alimentación y/o recogida de huevos. Entre éstas, gallinas y codornices están fácilmente disponibles y son fecundas como especies ponedoras de huevos y, por lo tanto, se prefieren.

Como vector retroviral que se usará en la puesta en práctica de la invención, pueden mencionarse vectores obtenidos de virus de la leucemia murina de Moloney (VLMMo) , virus de leucosis aviar (VLA) y similares, y vectores de lentivirus, y similares. Entre ellos, se prefieren los obtenidos de VLMMo, aunque el vector retroviral que se usará no está limitado a estos.

Desde el punto de vista de la seguridad, un vector con capacidad de autorreplicación deficiente como resultado de la deficiencia de cualquiera de los tres genes gag, pol y env, que son necesarios para la replicación de partículas virales, se usa generalmente como vector para la transferencia génica. Se prefiere para infectar eficazmente células de ave con este vector viral, un vector viral con su proteína de la envuelta pseudotipada artificialmente como VSV-G (obtenida del virus de la estomatitis vesicular) . El vector viral que se usará en la puesta en práctica de la invención no está limitado a este tipo viral, sin embargo.

El vector de pseudotipo viral preparado utilizando células empaquetadoras, un virus ayudante o similares se introduce en el embrión temprano, en un vaso sanguíneo y el corazón, mediante la técnica general de microinyección (Bosselman, R. A. et al. (1989) , Science, 243, 533) . Son concebibles como otras técnicas de transferencia génica las técnicas de lipofección y electroporación, y similares.

El gen que se introducirá en aves en la puesta en práctica... [Seguir leyendo]

1. Un método para construir un ave transgénica G1 que comprende: a) incubar un huevo de ave fertilizado, b) microinyectar en el corazón de su embrión temprano después de la fase blastodérmica, cuando el embrión

temprano está al menos 48 horas después del comienzo de la incubación, un vector retroviral de replicación deficiente que contiene un gen obtenido no de retrovirus que codifica un anticuerpo, c) dejar que el huevo eclosione para obtener, de este modo, un ave quimérica transgénica G0, y d) aparear a un ave quimérica transgénica G0 macho con un ave hembra de tipo silvestre.

2. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ave es una gallina o una codorniz.

3. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende microinyectar un vector retroviral de replicación deficiente que tiene un valor cuantitativo no inferior a 1 x 107 ufc/ml.

4. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende microinyectar un vector retroviral de replicación deficiente que tiene un valor cuantitativo no inferior a 1 x 109 ufc/ml.

5. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector retroviral de replicación deficiente es un vector obtenido de virus de la leucemia murina de Moloney.

6. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector retroviral de replicación deficiente es pseudotipado como VSV-G.

7. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen obtenido no de retrovirus está bajo el control del promotor de 1-actina de gallina.

8. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

9. El método para construir un ave transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el anticuerpo quimérico es un anticuerpo scFv-Fc.