Marcadores Fluorescentes.

Compuestos de fórmula I, donde los sustituyentes X o Y incorporan grupo fluoróforos.

Estos compuestos son útiles como marcadores fluorescentes.

MARCADORES FLUORESCENTES

La presente invención se refiere a marcadores fluorescentes, a su procedimiento de preparación y a su uso para monitorizar células vivas penetrando en el interior celular y acumulándose selectivamente en el aparato de Golgi.

ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR

La habilidad de distinguir e identificar diferentes compartimentos subcelulares es fundamental para tener un mayor conocimiento de la estructura y función de los diferentes orgánulos celulares, su biogénesis y el mantenimiento en las células, así como para definir las diferentes vías de transporte de proteínas, lípidos, etc. en el interior celular. Para ello, el uso de sondas fluorescentes es una de las herramientas más útiles de las que se dispone. La naturaleza de las sondas utilizadas es muy amplia y comprende desde nanocristales semiconductores, proteínas fluorescentes, hasta compuestos orgánicos de pequeño tamaño. En cualquier caso, los fluoróforos pueden formar enlaces covalentes o no covalentes, conduciendo a la formación de conjugados o complejos de las muestras analizadas.

Uno de los aspectos más importantes a considerar a la hora de preparar un nuevo marcador es la facilidad para penetrar en el interior celular atravesando, no tan solo la membrana celular exterior, sino las diferentes barreras intracelulares con las que puede encontrarse hasta alcanzar su objetivo. Los métodos más utilizados para favorecer la entrada de marcadores en el interior celular son la microinyección, el lisado hipertónico, "scrape holding" y la endocitosis entre otros. La mayoría de estos métodos son bastante agresivos para la célula y pueden distorsionar o impedir un estudio posterior con células vivas. La endocitosis es por lo tanto unos de los métodos más inocuos y rápidos para trabajar con células vivas en óptimas condiciones.

El complejo de Golgi es un orgánulo celular formado por una serie de vesículas

o sacos (cisternas) aplanados y limitados por membranas y en el que se pueden definir tres regiones (cis, medial y trans) . Las vesículas de transporte del retículo endoplasmático rugoso (RE) se fusionan con la región cis del complejo de Golgi donde depositan su contenido. En el complejo de Golgi se lleva a cabo una importante actividad enzimática, siendo una de las funciones más importantes la glicosilación de proteínas y lípidos. Una vez transformados los compuestos se transportan fuera del complejo por un segundo grupo de vesículas que parecen brotar del lado trans del complejo.

Se han descrito en la bibliografía numerosos marcadores fluorescentes. Entre ellos se puede destacar la solicitud WO 2008005942, donde se decribe un método de detección de tumores mediante marcadores fluorescentes que comprenden un resto BODIPY® unido a un grupo dialquilamino. Estos marcadores, sin embargo, no son capaces de alcanzar el aparato de Golgi.

En el estado de la técnica se han descrito marcadores que sí presentan la capacidad de marcar el aparato de Golgi, como por ejemplo, los marcadores descritos en US 20080268468 caracterizados porque en su estructura el resto BODIPY® se une a un resto de ceramida o los marcadores descritos en US 2006265764 donde el fluoróforo se une a un polipéptido. Estos marcadores, al estar unidos a restos de origen natural como son las ceramidas y los polipétidos, se metabolizan en el interior de la célula de forma que se destruye el marcador fluorescente.

Por tanto, sería deseable proporcionar marcadores fluorescentes capaces de penentrar en el interior de la célula y alcanzar el aparato de Golgi y que no se metabolizase y, por tanto, sin que se viese alterada la estructura y la naturaleza del marcador.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 1:

HN HN-Y

\ \

X-NH NH

donde:

cada X e Y independientemente representa: -- (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente sustituido por uno o más R2, -- (R1-NR3-R1) n-, o -un grupo de fórmula 11:

con la condición de que al menos uno de X e Y está sustituido por un grupo -L-A en cualquier posición disponible; cada R1 independientemente representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -CO-, -CONR5-, -C02-, -C02NR5-, -S-, -SO-, -S02-, -NR5-, -NR5CO-, -NR5C02-, O -CY1-, donde además - (C1-ClO) alquilenilo

está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R2 independientemente representa -OR5, -CN, -NR5R5, halógeno o -N02;

cada R3 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R4 independientemente representa (C1-ClO) alquilo, -OR5, -NR5R5, -NR5COR4, -S02R5 o CY1, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R5 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo; L representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -S-, -NR5-, -NR5CO-, -CO-, -SO-o CY1, donde - (C1-ClO) alquilenilo-está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada CY1 representa un anillo de 3 a 7 miembros, carbocíclico o heterocíclico, saturado, parcialmente insaturado o aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O Y S, donde uno o más átomos de C o S disponibles del anillo están opcionalmente oxidados formando grupos CO, SO o S02, y donde CY1 está opcionalmente sustituido por uno o más R4; A representa un grupo fluoróforo; y

n representa de 1 a 8.

Otro aspecto de la presenten invención se refiere al uso in vitro de un compuesto de fórmula I definido anteriormente como marcador celular, preferiblemente como marcador celular específico del aparato de Golgi.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula I definido anteriormente, que comprende: -hacer reaccionar un compuesto de fórmula 1 con un compuesto de fórmula 2

0) : (0 O O

donde X e Y tienen el significado descrito anteriormente; -la reacción entre un compuesto de fórmula 3 y un compuesto de fórmula 4

3 4

donde X e Y tienen el significado descrito anteriormente; o -transformando, en una o varias etapas, un compuesto de fórmula 1 en otro compuesto de fórmula 1.

A lo largo de la presente invención, el término El término " (C1-ClO) alquilo" se refiere a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. Ejemplos incluyen, entre otros, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, nbutilo, tert-butilo, sec-butilo y n-pentilo. Los radicales alquilo pueden estar

opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, halógeno, nitro, amino o amonio.

El término "- (C1-ClO) alquileno-" o "- (C1-ClO) alquilenilo-" se refiere a un radical divalente de (C1-ClO) alquilo. Ejemplos incluyen, entre otros, metilenilo, etilenilo, 15 propilenilo, isopropilenilo, butilenilo, tert-butilenilo, pentilenilo, isopentilenilo, y hexilenilo.

CY1 significa un anillo de 3 a 7 miembros que puede estar unido al resto de la molécula a través de cualquier posición disponible. CY1 puede ser carbocíclico o 20 heterocíclico, en el segundo caso puede contener de 1 a 4 heteroátomos en total seleccionados de entre N, O y S, donde los átomos de C y S disponibles pueden estar opcionalmente oxidados formando grupos CO, SO y S02. CY2 puede ser un anillo saturado, parcialmente insaturado o aromático. Y CY2 puede estar sustituido tal y como se ha mencionado anteriormente en la definición de un 25 compuesto de fórmula 1, dichos sustituyentes pueden ser iguales o diferentes y pueden estar situados en cualquier posición disponible de la molécula. Ejemplos de CY1 incluyen, entre otros, ciclobut-3-en-1 , 2-diona, escuaramida, fenilo, naftilo, tienilo, furilo, pirrol, tiazol, isotiazol, oxazol, isoxazol, imidazol, pirazol, 1, 2, 3

triazol, 1, 2, 4-triazol, 1, 3, 4-oxadiazol, 1, 3, 4-tiadiazol, piridilo, pirazilo, pirimidinilo, piridazilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

CY2 significa un grupo fenilo o a un heterociclo aromático de 5 ó 6 miembros que puede estar unido al resto de la molécula a...

1. Un compuesto de fórmula 1:

HN HN-Y

\ \

X-NH NH

donde:

cada X e Y independientemente representa: -- (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente sustituido por uno o más R2, -- (R1-NR3-R1) n-, o

- un grupo de fórmula 11:

11 con la condición de que al menos uno de X e Y está sustituido por un grupo -L-A en cualquier posición disponible;

cada R1 independientemente representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -CO-, -CONR5-, -C02-, -C02NR5-, -S-, -SO-,

- S02-, -NR5-, -NR5CO-, -NR5C02-, O -CY1-, donde además - (C1-ClO) alquileniloestá opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R2independientemente representa -OR5, -CN, -NR5R5, halógeno o -N02; cada R3 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo, donde

(C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R4 independientemente representa (C1-ClO) alquilo, -OR5, -NR5R5, -NR5COR4, -S02R5 o CY1, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R5 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo;

L representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -S-, -NR5-, -NR5CO-, -CO-, -SO-o CY1, donde - (C1-ClO) alquilenilo-está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada CY1 representa un anillo de 3 a 7 miembros, carbocíclico o heterocíclico, saturado, parcialmente insaturado o aromático que contiene de 1 a 4

heteroátomos seleccionados de N, O Y S, donde uno o más átomos de C o S disponibles del anillo están opcionalmente oxidados formando grupos CO, SO o S02, y donde CY1 está opcionalmente sustituido por uno o más R4; A representa un grupo fluoróforo; y

n representa de 1 a 8.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, donde X representa - (R1-NR3-R1) n-.

3. Un compuesto según la reinvidicación 1, donde X representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente sustituido por uno o más R2.

4. Un compuesto según la reivindicación 1, donde X representa un grupo de fórmula 11:

5. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Y representa - (R1-NR3-R1) n-.

6. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y 4 a 5, donde n representa de 1 a 6.

7. Un compuesto según la reivindicación 6, donde n representa 1.

8. Un compuesto según la reivindicación 1, de fórmula 111:

HN HN-R1

\ \

A R N-R

\ /1 / 3

L-N

R1

\ \

R1-NH NH

donde:

cada R1 independientemente representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -CO-, -CONR5--C02-, -C02NR5-, -S-, -SO-,

- S02-, -NR5-, -NR5CO-, -NR5C02-o -CY1-, donde además - (C1-ClO) alquileniloestá opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R2 independientemente representa -OR5, -CN, -NR5R5, halógeno o -N02; cada R3 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R4 independientemente representa (C1-ClO) alquilo, -OR5, -NR5R5, -NR5COR4, -S02R5 o CY1, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada R5 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo; L representa - (C1-ClO) alquilenilo-opcionalmente interrumpido por uno o más -0-, -S-, -NR5-, -NR5CO-, -CO-, -SO-o CY1, donde - (C1-ClO) alquilenilo-está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada CY1 representa un anillo de 3 a 7 miembros, carbocíclico o heterocíclico, saturado, parcialmente insaturado o aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O Y S, donde uno o más átomos de C o S disponibles del anillo están opcionalmente oxidados formando grupos CO, SO o S02, y donde CY1 está opcionalmente sustituido por uno o más R4; y A representa un grupo fluoróforo.

9. Un compuesto según cualquiera de las reinvidicaciones 1 a 8, donde cada R3 independientemente representa hidrógeno.

10. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde cada R3 independientemente representa (C1-ClO) alquilo y donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2.

11. Un compuesto según la reivindicación 10, donde cada R3 independientemente representa (C1-C1Q) alquilo.

12. Un compuesto según la reivindicación 11, donde cada R3 independientemente representa metilo.

13. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y 4 a 12, donde cada R1 independientemente representa - (C1-ClO) alquileniloopcionalmente sustituido por uno o más R2.

14. Un compuesto según la reivindicación 13, donde cada R1 independientemente representa - (C1-C1º) alqu i len i 10-.

15. Un compuesto según la reivindicación 14, donde cada R1 independientemente representa propilenilo.

1.

16. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde L representa - (C1-ClO) alquilenilo-interrumpido por un -NR5 CO-.

17. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde R2

representa -OR5.

18. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 donde A representa un grupo de fórmula IV:

IV donde: cada R6 independientemente representa hidrógeno, halógeno, (C1-ClO) alquilo, CY2, CY2- (C1-ClO) alquilo, -NR7 R7, -COR8 o -SOR8, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más Rg;

cada R7 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo;

cada Rs independientemente representa hidrógeno, (C1-ClO) alquilo, -OR7, -NR7R7 o -S02R7, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2; cada Rg independientemente representa -OR7, -CN, -NR7R7, halógeno o -N02;

y cada CY2 representa fenilo o un heterociclo aromático de 5 ó 6 miembros que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O Y S, Y que está opcionalmente sustituido por uno o más RlO ; cada RlO independientemente representa hidrógeno, (C1-ClO) alquilo, -OR5,

-NR5R5 o -S02R5, donde (C1-ClO) alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más R2.

19. Un compuesto según la reivindicación 18, donde cada R6 independientemente representa hidrógeno o (C1-ClO) alquilo.

1.

20. Un compuesto según la reivindicación 19, donde cada R6 independientemente representa hidrógeno o metilo.

21. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde 20 cada CY2 independientemente representa fenilo.

22. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde A representa un grupo de fórmula V caracterizado porque se une al resto de la molécula a través de cualquier átomo disponible:

V donde: cada R11, R12, R13 Y R14 independientemente representa hidrógeno o - (CH2) q-B;

Z representa -NH-, -0-, -S-, -CO-o -C (CH3h-; cada B independientemente representa -CH3, -C02R11 , -S03H, -OH o -N+R17R17R17; cada R17 independientemente representa hidrógeno o - (CH2) q-D;

cada O independientemente representa -CH3, -C02R11 , -S03H o -OH; m representa de 1 a 4; cada p independientemente representa de 1 a 3; y cada q independientemente representa de Oa 4.

23. Un compuesto según cualquiera de las reivindicacionesn 1 a 21, donde A representa un grupo de fórmula VI, VII, VIII o IX caracterizado porque se une al resto de la molécula a través de cualquier átomo disponible:

o

VI VII

o

VIII IX

donde: cada R11, R12, R13, R15 Y R 16 independientemente representa hidrógeno o - (CH2) q-B; cada B independientemente representa -CH3, -C02R11 , -S03H, -OH o -N+R17R17R17;

cada R17 independientemente representa hidrógeno o - (CH2) q-D;

cada O independientemente representa -CH3, -C02R11 , -S03H o -OH; cada p independientemente representa de 1 a 3; y cada q independientemente representa de Oa 4.

24. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde A representa puntos cuánticos formados por un núcleo de CdSe , CdTe , InP o InGaP.

25. Un compuesto según la reivindicación 1 seleccionado de:

aiN~

~H H ~N'Me

!N'L~ :)

arNH 'ira

o

26. Uso in vitro del compuesto de fórmula I de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 como marcador celular.

27. Uso según la reivindicación 26, como marcador celular específico del aparato de Golgi.

28. Proceso para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

-hacer reaccionar un compuesto de fórmula 1 con un compuesto de fórmula 2

o O O O

E) : (~X') : (

H H OEt

1 2 donde X e Y tienen el significado descrito anteriormente; -la reacción entre un compuesto de fórmula 3 y un compuesto de fórmula 4

3 4

donde X e Y tienen el significado descrito anteriormente; o -transformando, en una o varias etapas, un compuesto de fórmula I en otro compuesto de fórmula 1.