Línea celular neural inducible de deficiencia de frataxina.

La presente invención se refiere a una línea celular de origen neural y capaz de diferenciarse a células neuronales,

en la que se puede inducir la deficiencia de frataxina. La presente invención se refiere también al uso de dicha línea celular como modelo de la enfermedad de la ataxia de Friedreich para ensayos de alto rendimiento de búsqueda de moléculas con potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad.

Línea celular neural inducible de deficiencia de frataxina

La presente invención se refiere a una línea celular de origen neural y capaz de diferenciarse a células neuronales, en la que se puede inducir la deficiencia de frataxina. La presente invención se refiere también al uso de dicha línea celular como modelo de la enfermedad de la ataxia de Friedreich para ensayos de alto rendimiento de búsqueda de moléculas con potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La ataxia de Friedreich (AF) es la ataxia hereditaria más frecuente, con una prevalencia en España de casi 5 enfermos por cada 1 00.000 habitantes. Desde el punto de vista genético, la ataxia de Friedreich es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen Fxn (localizado en el cromosoma 9q13) . Este gen codifica para una proteína denominada frataxina, cuya localización y función ocurre en la mitocondria (Campuzano et al. 1996. Science 5254; 1423-1427) .

La mutación mayoritariamente responsable de la AF consiste en una expansión de un trinucleótido GAA repetido, localizada en el primer intrón del gen de la frataxina. Dicha expansión tiene un efecto inhibidor de la transcripción del gen, por lo que conlleva una reducción de la expresión de la frataxina (Sakamoto et al. 1999. Molecular Cell 3; 465-475) .

Tanto la edad de la aparición de la enfermedad como la severidad de la misma están inversamente correlacionadas con la longitud de la expansión de tripletes GAA. A mayor longitud de expansión se observa un nivel celular menor de frataxina, y la enfermedad es más severa y de inicio más temprano. Así pues, la deficiencia de frataxina parece ser la responsable del proceso degenerativo que caracteriza la AF. La mayoría de los pacientes presentan niveles de frataxina en torno al 5-10% de los niveles normales. Los pacientes con las formas de AF de inicio más tardío y afectación menos drástica tienen niveles de frataxina en torno al 20-25% de los niveles normales. Las personas portadoras presentan unos niveles de frataxina en torno al 55-60% de los niveles normales y no manifiestan ningún signo clínico de la enfermedad (Pianese et al. 2004. Journal of neurology, neurosurger y and psychiatr y 75; 1061-1 063)

El proceso neurodegenerativo típico de la AF afecta preferentemente a algunos tipos de neuronas en los ganglios espinales dorsales, en la médula espinal, en el tronco del encéfalo y en el cerebelo. Las regiones más afectadas son la médula espinal (fundamentalmente los tractos espinocerebelosos, las columnas posteriores y las raíces dorsales) y el núcleo dentado del cerebelo. La manifestación extraneu rológica más importante es la cardiomiopatía hipertrófica, presente en entre el 70 y el 90 % de los pacientes. Además, entre el 1 O y el 30% de los enfermos de AF desarrollan diabetes mellitus (Palau, F. 2001. lnternational Journal of Molecular Medicine 7; 581-589) .

Se han utilizado diferentes modelos experimentales para avanzar en la comprensión de la función biológica de la frataxina, así como para entender los mecanismos moleculares patogénicos implicados en la enfermedad. Como modelos celulares, se han utilizado tanto cultivos primarios de fibroblastos (Calmels et al. 2009. PloS one 4; e6379) o de linfoblastos (Pastare et al. 2003. The Journal of biological chemistr y 278; 42588-42595) de pacientes con AF, como líneas celulares establecidas en las que se ha inducido una deficiencia de frataxina mediante distintos procedimientos, incluyendo ribozimas específicos o ARN de interferencia.

Biochimica et Biophysica Acta 1972; 1052-1061 ) . Sin embargo, Lu y colaboradores se han centrado en el efecto de la deficiencia de frataxina en las líneas de células de Schwann, y no han estudiado en profundidad el mecanismo de neurodegeneración en líneas neuronales. Más aún, no han encontrado coherencia en los resultados de viabilidad en las distintas líneas neuronales estudiadas.

El desarrollo de modelos celulares neuronales de deficiencia de frataxina es actualmente una necesidad para el descubrimiento de sustancias terapéuticas dirigidas a retrasar o inhibir el proceso neurodegenerativo característico de la enfermedad.

Otra dificultad asociada al manejo de los modelos celulares de deficiencia de frataxina proviene del hecho de que dicha deficiencia provoca una disminución de la proliferación celular. Así pues, existe una fuerte presión selectiva en contra de las células deficientes de frataxina. Como consecuencia de ello, se ha descrito que las líneas celulares de fibroblastos van incrementado el nivel de frataxina con los pases sucesivos. La única manera de solventar este problema, que es inherente al déficit proliferativo de las células deficientes de frataxina, es el desarrollo de modelos celulares en los que sea posible inducir la deficiencia de frataxina.

En resumen, es preciso solventar las dos carencias principales en el ámbito de los modelos celulares de deficiencia de frataxina: la ausencia de modelos celulares neuronales y la posibilidad de inducir la deficiencia de frataxina.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un nuevo modelo celular de la ataxia de Friedreich (AF) , constituido por una célula, línea o población celular de origen neural capaz de diferenciarse a células neuronales y en la que se puede inducir la deficiencia de frataxina (Fxn) . La ventaja principal de que la deficiencia de frataxina pueda inducirse en la célula de la invención es que se puede controlar temporalmente la expresión de la frataxina. Así, se puede mantener a la célula en proliferación o bien diferenciarla a neuronas, sin que se vea afectada su viabilidad por la ausencia de frataxina, y activar la deficiencia de frataxina en el momento deseado para provocar la neurodegeneración.

Concretamente, la presente invención muestra la obtención de líneas clonales estables de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y capaces de diferenciarse a células neuronales y en las que es posible la inducción de la deficiencia de frataxina mediante la adición de un análogo de tetraciclina, como la doxiciclina, al medio de cultivo.

Las líneas clonales inducibles obtenidas a partir de la transducción del neuroblastoma humano SH-SY5Y con un vector lentiviral inducible por doxiciclina, pueden diferenciarse a células neuronales en las que es posible inducir una deficiencia de frataxina, lo que dispara un proceso neurodegenerativo. Estas líneas permiten estudiar las bases moleculares de dicho proceso neurodegenerativo, así como ensayar el efecto de potenciales sustancias terapéuticas que puedan detener o retrasar dicho proceso neurodegenerativo.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una célula neural (en adelante llamada célula de la invención) que comprende un vector de expresión de un ARN de interferencia de la frataxina, controlado por un operador inducible.

El término "neural", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere al origen del tejido del que procede la célula o línea celular. El origen neural se refiere a un tejido del sistema nervioso. A nivel celular, el término neural hace referencia a los tres linajes o tipos celulares que incluyen las neuronas, los astrocitos y los oligodendrocitos.

1. Una célula neural que comprende un vector de expresión de un ARN de interferencia de la frataxina, controlado por un operador inducible.

2. La célula neural según las reivindicaciones 1 donde el vector comprende la secuencia del ARN de interferencia de la frataxina con SEO ID NO: 1.

3. La célula neural según las reivindicaciones 1-2 donde el vector es un vector lentiviral.

4. La célula neural según las reivindicaciones 1-3 donde el vector comprende el módulo TetO.

5. La célula neural según las reivindicaciones 1-4 donde el vector comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión TetR-KRAB.

6. La célula neural según las reivindicaciones 1-5 donde el vector comprende una secuencia que codifica para un marcador.

7. La célula neural según la reivindicación 6 donde el marcador es la proteína verde fluorescente (GFP) .

8. La célula neural según las reivindicaciones 1-7 donde el vector es SEO ID N0:2.

9. Una línea celular neural que comprende la célula según las reivindicaciones 1-8.

1O. Una línea celular según la reivindicación 9 donde la línea celular neural es neuronal.

11. La línea celular según las reivindicaciones 9-1 O donde la línea celular es la línea de neuroblastoma humano SH-SY5Y.

12. Una población celular que comprende la célula según las reivindicaciones 1-5 8 o la línea celular según las reivindicaciones 9-1 O.

13. Un uso de la célula neural según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la identificación de moléculas con potencial terapéutico para el tratamiento de la ataxia de Friedreich.

14. Un método de búsqueda e identificación de sustancias potencialmente útiles

en el tratamiento de la ataxia de Friedreich que comprende:

a) cultivar la célula neural según las reivindicaciones 1-8,

b) inducir la expresión del ARN de interferencia de la frataxina en la

célula neural de (a) , e) poner en contacto la célula neural obtenida en (b) y/o la célula neural del paso (a) con la sustancia a ensayar, y d) cuantificar la supervivencia de la célula neural de paso (e) .