Ligandos de MEK y polinucleótidos que codifican ligandos de MEK.
Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO:
1,en el que dicho polipéptido modula la actividad de MEK.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/058531.
Solicitante: INTREXON CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1872 PRATT DRIVE VTCRC LAB, SUITE 1400 BLACKBURG, VIRGINIA 24060 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: BACHINSKY,DAVID, CARSON,JONATHAN, ATZEL,AMY, REED,THOMAS.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/43 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Enzimas; Proenzimas; Sus derivados.
- C12N9/12 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
PDF original: ES-2390156_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Ligandos de MEK y polinucleótidos que codifican ligandos de MEK
Campo de la invención
La invención se refiere a ligandos, sustratos y moduladores de cinasas de mamífero. En particular, la invención se refiere a polipéptidos, composiciones polipeptídicas y polinucleótidos que codifican polipéptidos que son ligandos, sustratos y/o moduladores de MEK. La invención también se refiere a poliligandos que son homopoliligandos o heteropoliligandos que modulan la actividad de MEK. La invención también se refiere a ligandos y poliligandos localizados en una región subcelular.
El objeto de esta solicitud está relacionado con el de las solicitudes n.º 10/724532 (actualmente US 7071295) , nº 10/682764 (US 2004/0185556, PCT/US2004/013517, WO 2005/040336) , nº 11/233246 y nº US 20040572011 P (WO 2005116231) .
Antecedentes y técnica anterior
Las cinasas son enzimas que catalizan la adición de un fosfato a una molécula. La adición de fosfato mediante una cinasa se denomina fosforilación. Cuando el sustrato de la cinasa es una molécula proteínica, los aminoácidos que habitualmente se fosforilan son serina, treonina y tirosina. Las fosfatasas son enzimas que eliminan el fosfato de una molécula. La eliminación del fosfato se denomina desfosforilación. Las cinasas y las fosfatasas a menudo representan fuerzas antagonistas dentro de la célula para transmitir, atenuar o modular de otro modo las señales celulares y los mecanismos de control celular. Las cinasas y las fosfatasas tienen sustratos naturales tano comunes como únicos. Las señales celulares y los mecanismos de control, regulados por las cinasas, las fosfatasas y sus sustratos naturales son una diana en el diseño de herramientas de investigación y en el diseño de fármacos.
La cinasa MAP/ERK 1, MEK1, PRKMK1, MAPKK1, MAP2K1, MKK1 son la misma enzima, conocida como MEK1. La cinasa MAP/ERK 2, MEK2, PRKMK2, MAPKK2, MAP2K2, MKK2 son la misma enzima, conocida como MEK2. MEK1 y MEK2 pueden fosforilar los residuos serina, treonina y tirosina en sustratos proteínicos o peptídicos. Hasta la fecha, se han identificado pocas isoformas de sustratos de MEK celulares. Aunque se han identificado y estudiado sustratos o ligandos individuales, no se han demostrado ligandos mixtos enlazados en forma de poliligandos que modulen la actividad de las isoformas de MEK antes de esta invención.
El diseño y la síntesis de ligandos polipeptídicos que modulan la proteína cinasa dependiente de calcio/calmodulina y que se localizan al retículo sarco (endo) plasmático cardíaco han sido realizados por Ji et al. (J Biol Chem (2003)
278: 25063-71) . Ji et al. lo consiguieron generando construcciones de expresión que localizaron ligandos inhibidores de la proteína cinasa dependiente de calcio/calmodulina al retículo sarcoplasmático fusionando una señal de localización al retículo sarcoplasmático derivada de una fosfolamban a un ligando polipeptídico. Véase también el documento US 7071295.
Descripción detallada de secuencias de polipéptidos y polinucleótidos
Las SEQ ID NOS: 1-36 son poliligandos ejemplares y los polinucleótidos que los codifican.
En concreto, el poliligando de MEK de la SEQ ID NO: 1 es codificado por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, en el que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en el que las SEQ ID NOS: 3-4 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. La SEQ ID NO: 1 es una realización de un poliligando de la estructura A-S1-B-S2-C-S3-D, en el que A es la SEQ ID NO: 41, B es la SEQ ID NO: 42, C es la SEQ ID NO: 49 y D es la SEQ ID NO: 43, en el que Xaa es alanina o fenilalanina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG y S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. Un poliligando de estructura A-S1-B-S2-C-S3-D también se denomina en el presente documento heteropoliligando, como se muestra de forma genérica en la figura 4D.
La SEQ ID NO: 5 es una realización de un poliligando de la estructura X-S1-X-S2-Y-S3-Z, en el que X es la SEQ ID NO: 44 y es la SEQ ID NO: 42, Z es la SEQ ID NO: 43, en el que Xaa es alanina o fenilalanina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG, S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. El poliligando de MEK de la SEQ ID NO: 5 es codificado por la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7 y por la SEQ ID NO: 8, en el que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en el que las SEQ ID NOS: 7-8 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. Un poliligando de estructura X-S1-X-S2-Y-S3-Z también se denomina en el presente documento un heteropoliligando, como se muestra de forma genérica en la figura 4E.
La SEQ ID NO: 9 es codificada por la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, en la que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en la que las SEQ ID NOS: 11-12 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. La SEQ ID NO: 1 es una realización de un poliligando de la estructura A-S1-B-S2-C-S3-D, en el que A es la SEQ ID NO: 41, B es la SEQ ID NO: 42, C es la SEQ ID NO: 49 y D es la SEQ ID NO: 43, en el que Xaa es serina, treonina o tirosina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG y S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. Un poliligando de estructura A-S1-B-S2-C-S3-D también se denomina en el presente documento heteropoliligando, como se muestra de forma genérica en la figura 4D.
La SEQ ID NO: 13 es una realización de un poliligando de la estructura X-S1-X-S2-Y-S3-Z, en el que X es la SEQ ID NO: 44 y es la SEQ ID NO: 42, Z es la SEQ ID NO: 43, en el que Xaa es serina, treonina o 10 tirosina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG, S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. El poliligando de MEK de la SEQ ID NO: 13 es codificado por la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15 y por la SEQ ID NO: 16, en el que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en el que las SEQ ID NOS: 15-16 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. Un poliligando de estructura X-S1-X-S2-Y-S3-Z también se denomina en el presente documento un heteropoliligando, como se muestra de forma genérica en la figura 4E.
La SEQ ID NO: 17 es codificada por la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, en la que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en el que las SEQ ID NOS: 19-20 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. La SEQ ID NO: 17 es una realización de un poliligando de la estructura A-S1-B-S2-C-S3-D, en el que A es la SEQ ID NO: 51, B es la SEQ ID NO: 43, C es la SEQ ID NO: 42 y D es la SEQ ID NO: 44, en el que Xaa es serina, treonina o tirosina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG y S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. Un poliligando de estructura A-S1-B-S2-C-S3-D también se denomina en el presente documento heteropoliligando, como se muestra de forma genérica en la figura 4D.
La SEQ ID NO: 21 es codificada por la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, en la que los codones han sido optimizados para la expresión en mamíferos y la inserción de vectores y en el que las SEQ ID NOS: 23-24 contienen sitios de restricción alternativos en los flancos que pueden emplearse en los procedimientos de clonación modular. La SEQ ID NO: 21 es una realización de un poliligando de la estructura A-S1-A-S2-A, en el que A es la SEQ ID NO: 45, en el que Xaa es alanina o fenilalanina y en el que S1 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG y S2 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PAGGA y S3 es un espaciador con la secuencia de aminoácidos PGAAG. Un poliligando... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1, en el que dicho polipéptido modula la actividad de MEK.
2. El polipéptido de la reivindicación 1 enlazado a una señal de localización subcelular, a un testigo y/o a un marcador de epítopo.
3. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido aislado de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
4. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 3.
5. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de la reivindicación 4.
6. Un procedimiento in vitro de inhibir MEK en una célula que comprende transfectar el vector de la reivindicación 5 a una célula huésped y cultivar la célula huésped transfectada en condiciones adecuadas para producir al menos una copia del polipéptido.
7. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido aislado de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el polinucleótido está flanqueado en un extremo por una secuencia que puede ser escindida por una primera endonucleasa de restricción y en el que el polinucleótido está flanqueado en el otro extremo por una secuencia que puede escindirse mediante una segunda endonucleasa de restricción y en el que las endonucleasas de restricción primera y segunda generan extremos cohesivos no compatibles.
8. El vector de la reivindicación 4, en el que dicho vector es un vector adenovirus.
9. El vector de la reivindicación 4, en el que dicho vector es un plásmido.
VVN-40637 CMV UTR-1 Kozak MEK1 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 12
VVN-40639 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-1 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 13
VVN-40641 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-2 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 14
VVN-40643 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-3 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 15
VVN-40645 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-4 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 16
VVN-40647 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-5 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 17
VVN-40649 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-6 LacZ HGHpA en VVN-3836
FIGURA 18
VVN-40650 UTR-1 Legacy-MEK-Dcy-45-7 LacZ en VVN-3688
FIGURA 19
VVN-40651 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-7 LacZ hGHpA en VVN-3836
FIGURA 20
VVN-40652 UTR-1 Legacy-MEK-Dcy-45-8 LacZ en VVN-3688
FIGURA 21
VVN-40653 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-8 LacZ hGHpA en VVN-3836
FIGURA 22
VVN-40654 UTR-1 Legacy-MEK-Dcy-45-9 LacZ en VVN-3688
FIGURA 23
VVN-40655 CMV UTR-1 Kozak Legacy-MEK-Dcy-45-9 LacZ hGHpA en VVN-3836
FIGURA 24
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