Polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, o un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y además, uno a 20 aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos, en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 es derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en el que el polipéptido confiere una cantidad de producción mayor de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje cuando el polipéptido es expresado en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

Procedimiento para la producción de L-glutamina.

Campo técnico

La presente exposición se refiere a un procedimiento para producir L-glutamina.

Antecedentes de la técnica Como procedimientos para producir L-glutamina mediante fermentación, se conocen uno que implica una bacteria corineforme dotada de resistencia a la azaserina (cf Patente Referencia 1) , otro que implica una bacteria corineforme dotada de resistencia a la 6-diazo-5-oxo-norleucina (cf Patente Referencia 2) y similares. Además, como procedimientos para producir L-glutamina mediante refuerzo de la actividad glutamina sintetasa, se conocen los que implican una bacteria corineforme con una actividad glutamino-sintetasa adenilil-transferasa reducida que es controlada mediante adenililación (cf No patente Referencia 1, Patente Referencia 3) , y una bacteria corineforme en la que es sustituido un aminoácido en posición 405 de la glutamina sintetasa que se somete a adenililación, y una bacteria corineforme que posee una actividad disminuida de la proteína PH (No-patente Referencia 2, Patente Referencia 3) .

Es conocido que, además de la glnA que codifica una glutamina-sintetasa, en el genoma de las bacterias corineformes se encuentra glnA2, que codifica una glutamina sintetasa 2 que presenta homología con glutamina sintetasa. Se informó de que el polipéptido codificado por glnA2 de una bacteria corineforme, presenta una alta homología con una glutamina sintetasa de Bacillus subtilis que no está controlada por adenililación, pero la bacteria corineforme muestra fenotipo glutamin-auxotrófico cuando glnA que codifica una glutamina sintetasa que es controlada mediante adenililación, es desactivada (No patente Referencia 1) . En las bacterias corineformes, el polipéptido codificado por glnA2 no tiene actividad glutamín sintetasa, no existiendo casos en los que la L-glutamina fuera obtenida mediante modificación de glnA2.

Además, se informó de que en Cor y nebacterium glutamicum, el ácido glutámico se produce mediante reducción de la actividad de un polipéptido que es codificado por ItsA y que está implicado en la sensibilidad a la lisozima, (no patente, Referencia 3, no-patente Referencia 4, Patente Referencia 4) .

Patente Referencia 1: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 148094/80 Patente Referencia 2: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 232497/91 Patente Referencia 3: solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 3008887/02 Patente Referencia 4: documento WO 00/14241 No-patente Referencia 1: FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001) No-patente Referencia 2: FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999) No-patente Referencia 3: BMC Biotechnol., 1, 9 (2001) No-patente Referencia 4: Journal of Bacteriology, 182, 2696 (2000)

Exposición de la invención Problemas que deben ser resueltos por la invención Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una glutamina sintetasa 2 modificada, un ADN que codifique la glutamina sintetasa 2 modificada, un ADN recombinante que incluya el ADN, un transformante que traslade el ADN recombinante, un microorganismo que comprende el ADN en su cromosoma, y un procedimiento para producir L-glutamina que utilice el transformante o el microorganismo.

Medios para resolver los problemas La presente invención se refiere a las formas de realización que se caracterizan en las reivindicaciones. Así, se refiere a lo siguiente:

1. Un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, se sustituye con un aminoácido distinto al ácido glutámico en la que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, se deriva de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en la que el polipéptido confiere una cantidad producida más copiosa de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje, cuando el polipéptido se expresa en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

2. El polipéptido según el apartado 1, que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en

posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, eliminándose, sustituyéndose o añadiéndose, además, uno o más aminoácidos.

3. El polipéptido según el apartado 1, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que un

aminoácido en posición 64 a partir del terminal N, en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico.

4. El polipéptido según el apartado 2, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición 64 a partir del N-terminal en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, eliminándose, sustituyéndose o añadiéndose, además, uno o más aminoácidos.

5. Un ADN seleccionado de los (a) y (b) siguientes:

(a) un ADN que codifica el polipéptido según cualquiera de los apartados 1 a 4;

(b) un ADN que hibrida un ADN formado por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5 en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un cordón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, en el que una cantidad producida de L-glutamina, en un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje, es más copiosa que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

6. El ADN según el apartado 5, que codifica el polipéptido según cualquiera de los apartados 1 a 4, y comprende; 25

(a) una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5' en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, o (b) una secuencia nucleotídica en la que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5' en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

7. El polipéptido o ADN según cualquiera de los apartados 1 a 6, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico, es un aminoácido básico.

8. El polipéptido o el ADN según cualquiera de los apartados 1 a 6, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es la lisina. 40

9. Un ADN recombinante que incluye el ADN según cualquiera de los apartados 5 a 8.

10. Un microorganismo seleccionado a partir de (a) y (b) :

45 (a) un microorganismo transformado con el ADN recombinante según el apartado 9;

(b) un microorganismo que comprende, en su ADN cromosómico, el ADN según cualquiera de los apartados 5 a 8.

11. El microorganismo según el apartado 10, que posee capacidad para producir un polipéptido que incluye una secuencia aminoácida en la que uno o varios aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia 50 aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme y que posee sensibilidad a la lisozima.

12. El microorganismo según el apartado 11, en el que polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en la posición que corresponde al aminoácido en posición 80 a partir del extremo N en la secuencia 55 aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

13. El microorganismo según el apartado 11, en el que;

(a) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10; o 60

(b) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, y el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en posición... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, o un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que, en la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2, un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto al ácido glutámico, y además, uno a 20 aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos, en el que la secuencia aminoácida de una glutamina sintetasa 2 es derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, y en el que el polipéptido confiere una cantidad de producción mayor de L-glutamina en una bacteria corineforme de tipo salvaje cuando el polipéptido es expresado en la bacteria corineforme de tipo salvaje como célula huésped, que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto del ácido glutámico, o un polipéptido en el que la secuencia aminoácida es una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 64 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 1, es sustituido con un aminoácido distinto del ácido glutámico, y además uno a 20 aminoácidos pueden eliminarse, sustituirse o añadirse.

3. ADN seleccionado de los (a) y (b) siguientes:

(a) un ADN que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2;

(b) un ADN que hibrida con un ADN constituido por una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, bajo condiciones estrictas, y que comprende una secuencia nucleotídica en la que una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5' en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto del ácido glutámico, en el que una cantidad de producción de L-glutamina, en un transformante obtenido introduciendo el ADN en una bacteria corineforme de tipo salvaje es mayor que la de la bacteria corineforme de tipo salvaje.

4. ADN según la reivindicación 3, que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2, y comprende;

(a) una secuencia nucleotídica en la que, en la secuencia nucleotídica de un ADN que codifica la glutamina sintetasa 2 derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme, una región que corresponde a la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5' en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico, o

(b) una secuencia nucleotídica en la que la secuencia nucleotídica en las posiciones 190 a 192 a partir del extremo 5' en la secuencia nucleotídica de SEC ID nº 2, es un codón que codifica un aminoácido distinto al ácido glutámico.

5. Polipéptido o ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico, es un aminoácido básico.

6. Polipéptido o ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido distinto al ácido glutámico es la lisina.

7. ADN recombinante que comprende el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

8. Microorganismo seleccionado de entre los (a) y (b) siguientes:

(a) un microorganismo transformado con el ADN recombinante según la reivindicación 7;

(b) un microorganismo que comprende, en su ADN cromosómico, el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

9. Microorganismo según la reivindicación 8, que presenta la capacidad de producir un polipéptido que comprende una secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos o añadidos en la secuencia aminoácida de LtsA derivada de un microorganismo que pertenece a una bacteria corineforme y que presenta sensibilidad a la lisozima.

10. Microorganismo según la reivindicación 9, en el que polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que un aminoácido en una posición que corresponde al aminoácido en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10 es un aminoácido distinto a la glicina.

11. Microorganismo según la reivindicación 9, en el que;

(a) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10; o 5

(b) la secuencia aminoácida de LtsA es la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, y el polipéptido comprende una secuencia aminoácida en la que el aminoácido en la posición 80 a partir del extremo N en la secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, es un aminoácido distinto a la glicina.

12. Microorganismo según la reivindicación 10 u 11, en el que el aminoácido distinto de la glicina, es el ácido aspártico.

13. Polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Cor y nebacterium, el género Brevibacterium o 15 el género Mycobacterium.

14. Polipéptido, ADN, ADN recombinante o microorganismo según la reivindicación 13, en el que el microorganismo que pertenece al género Cor y nebacterium es Cor y nebacterium glutamicum.

15. Procedimiento para producir L-glutamina, que comprende cultivar el microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 en un medio para formar y acumular L-glutamina en un cultivo, y recuperar la L-glutamina a partir del cultivo.