Un conjunto de cebadores que consiste en el siguiente par de cebadores:

a) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

Procedimiento para la detección y el diagnóstico del cáncer que implica cebadores y sondas para la detección específica del marcador MAGE-A3

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico para la detección de MAGE-A3.

Antecedentes de la Invención

La familia de genes MAGE (antígeno del Melanoma) se identificó originalmente debido al reconocimiento de los linfocitos citolíticos derivados de linfocitos de sangre de pacientes con cáncer (Van der Bruggen y col., 1991) . La familia de genes MAGE comprende actualmente más de 20 miembros y está constituida por los genes MAGE A, B, C y D (Scanlan y col., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez y col., (2001) Cancer Res. 61 (14) :5544-51) . Estos están agrupados en el cromosoma X (Lucas y col., 1998 Cancer Res. 58:743-752; Lucas y col., 1999 Cancer Res 59:4100-4103; Lucas y col., 2000 Int J Cancer 87:55-60; Lurquin y col., 1997 Genomics 46:397-408; Muscatelli y col., 1995 Proc Natl Acad Sci E.U.A., 92:4987-4991; PoId y col., , 1999 Genomics 59: 161-167; Rogner y col., 1995 Genomics 29:725-731) , y tienen una función aún no definida (Ohman y col., 2001 Exp Cell Res. 265 (2) : 185-94) . Los genes MAGE son altamente homólogos y los miembros de la familia MAGE-A, especialmente, tienen una homología entre 60 - 98 %. Los genes MAGE no se expresan en todas las células normales salvo en las espermatogonias y en la placenta (Haas y col., 1988 Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi y col., 1995 Cancer Res 55:3478-382) .

La re-activación de la expresión de los genes MAGE en el cáncer se debe en parte a una desmetilación anómala del promotor (De Smeet y col., 1996 Proc Natl Acad Sci E.U.A., 93 (14) :7149-53; De Smeet y col., 1999 MoI Cell Biol. 19 (11) :7327-35) . Los 12 genes MAGE-A se sobre-expresan de forma variable en los siguientes cánceres: carcinoma de células transicionales, carcinoma esofágico, melanoma, carcinoma de vejiga y carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) (Scanlan y col., 2002 Immunol Rev. 188:22-32) . La sobre-expresión y especificidad de la expresión de MAGE en tejidos cancerosos, ha conducido a que la proteína MAGE-A3 se utilice para vacunas contra el cáncer (Scanlan y col., 2002 Immunol Rev. 188:22-32) . Sin embargo, debido al amplio intervalo de expresión encontrado en pacientes con cáncer, el nivel de expresión de MAGE-A3 debe calcularse exactamente en cada paciente para dirigir la vacunación hacia pacientes que expresan la proteína. Con frecuencia la proteína MAGE-A3 se denomina indistintamente MAGE-3; ambos términos se usan en la presente invención.

Melanoma

Los pacientes que presentan melanoma maligno en metástasis distante (fase IV de acuerdo con la clasificación del Comité de Unión Americana en Cáncer (American Joint Committee on Cancer (AJCC) ) tienen un tiempo de supervivencia promedio de un año, con un índice de supervivencia a largo plazo únicamente del 5 %. Incluso la quimioterapia convencional para el melanoma en fase IV tiene índices de respuesta terapéuticos únicamente del 825 %, pero sin efecto en la supervivencia general. Los pacientes con metástasis regionales (fase III) tienen una supervivencia promedio de dos a tres años con muy poca oportunidad de supervivencia a largo plazo, incluso después de un control quirúrgico adecuado de las metástasis primarias y regionales (Balch y col., 1992 Semin Surg Oncol. 8 (6) :400-14) . La mayoría de los pacientes con melanoma en fase I a III tienen su tumor extirpado quirúrgicamente, aunque estos pacientes mantienen un riesgo sustancial de recaída. Por lo tanto sigue existiendo una necesidad para prevenir el avance del melanoma, y de tener regímenes de tratamiento mejorados para el melanoma metastásico y tratamientos complementarios para pacientes que han tenido un tumor primario extirpado.

Cáncer de pulmón

Existen dos tipos de cáncer de pulmón; el cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC, por las siglas en inglés Non-Small Cell Lung Cancer) y el cáncer pulmonar microcítico (SCLC, por las siglas en inglés Small Cell Lung Cancer ) . Los nombres simplemente describen el tipo de célula encontrada en los tumores. El NSCLC incluye carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y carcinoma de células grandes y representa aproximadamente el 80 % de los cánceres de pulmón. El NSCLC es difícil de curar y los tratamientos disponibles tienden a tener el objetivo de prolongar la vida hasta donde sea posible y aliviar los síntomas de la enfermedad. El NSCLC es el tipo más común de cáncer de pulmón y se asocia con malos resultados. De todos los pacientes con NSCLC, aproximadamente el 25 % tiene una enfermedad loco-regional en el momento del diagnóstico y aún son candidatos de extirpación quirúrgica (fases IB, II A o IIB de acuerdo con la clasificación del AJCC) . Sin embargo, más del 50 % de estos pacientes recaerán dos años después de la resección quirúrgica total. Por lo tanto existe la necesidad de proporcionar un mejor tratamiento para estos pacientes.

Expresión de MAGE-A3

Anteriormente, diversos procedimientos han intentado medir la expresión de los genes MAGE-A3 tanto dentro de líneas celulares como de muestras de tumor. Se han usado técnicas por RT-PCR semi-cuantitativa (De Plaen y col., 1994 Immunogenetics 40 (5) :360-9) , otras técnicas basadas en PCR y también en micromatrices de baja densidad

(Zammatteo y col., 2002 Clinical Chemistr y 48 (1) 25-34) . Sin embargo, en muchos de estos estudios, un problema principal ha sido la muy alta homología entre los miembros de la familia MAGE que producen positivos falsos. Para pruebas amplias de Fase II y III, se desea un ensayo cuantitativo de alto rendimiento, que sea capaz de identificar específicamente muestras que expresen MAGE-A3 y de reducir la probabilidad de muestras falsamente positivas en ensayos.

Otra dificultad surge con el uso de tejido tumoral Fijado en Formol e Incluido en Parafina (FFPE, por las siglas en inglés Formalin Fixed Paraffin Embedded) , que es el procedimiento habitual de conservación de tejido tumoral en los centros clínicos. La fijación en formol cambia la estructura de las moléculas de ARN dentro del tejido, produciendo reticulación y también degradación parcial. La degradación parcial conduce a la creación de trocitos de ARN de entre 100 a 300 pares de bases. En técnicas de diagnóstico convencionales, estos cambios estructurales del ARN dificultan el uso de ARN extraído de tejido FFPE.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1: Especificidad de cebadores de MAGE-A3 para la RT-PCR TaqMan dentro los miembros de la familia MAGE-A. Figura 2: Especificidad de la sonda de Unión al Surco Menor (MGB, por las siglas Minor Groove Binding) para la RT-PCR TaqMan para la expresión de MAGE-A3. Figura 3: Ensayo de especificidad de cebadores MAGE-A3 en presencia de plásmidos MAGE-A3 y MAGE-6. Figura 4: Expresión Tumoral de MAGE-A3 medida por PCR TaqMan cuantitativa. Figura 5: Ensayo de expresión de MAGE-A3. Figura 6a: Especificidad de los cebadores de MAGE-A3 diseñados para usar en tejidos FFPE. Figura 6b: Ensayo de linealidad de los cebadores sobre cantidades diferenciales de ARN. Figura 7: Comparación entre el ensayo de congelación con ARN later y la PCR con tejido FFPE. Figura 8: Comparación relativa de los ensayos de congelación con ARN later y MAGE-A3 basado tejido FFPE. Figura 9: Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión del fragmento de Lipoproteína D, fragmento Mage3, y cola de histidina, y su secuencia de aminoácidos respectiva (SEC ID NO: 35 y 36) . Figura 10: Proteína de fusión de NS1-MAGE3, y cola de Histidina (SEC ID NO:37) . Figura 11: ADN que codifica la proteína de fusión NS1-MAGE3-His (SEC ID NO:38) . Figura 12: Proteína de fusión de CLYTA-MAGE3-Histidina (SEC ID NO:39) . Figura 13: ADN de la proteína de fusión CLYTA-MAGE3-His (SEC ID NO:40) . Figura 14: Alineamiento de secuencias de la familia de genes MAGE-A3 para el diseño de cebadores y sondas de la RT-PCR para MAGE-A3. Figura 15: Alineamiento de secuencias de MAGE-A3 y MAGE-A6 para identificar regiones que contienen secuencias diana (tipografía en recuadro) . Figura 16: Clases para RT-PCR semi-cuantitativa para MAGE-A3: un ejemplo de cómo pueden asignarse cinco clases al ensayo por RT-PCR semi-cuantitativa para MAGE-A3. Figura 17: Comparación Gráfica de valores de Ct de Plásmidos de MAGE-A usando 20, 2, 0.2 0.02 pg de ADN. Figura 18: Comparación Gráfica de valores de Ct Delta en relación con MAGE-A3 para otros plásmidos... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de cebadores que consiste en el siguiente par de cebadores:

a) SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

2. Una sonda que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de (cualquiera de) la SEC ID NO:17, que tiene un colorante indicador fluorescente en el extremo 5’ y un extintor no fluorescente en el extremo 3’ o; b) la SEC ID NO: 53.

3. Un kit que comprende (i) un cebador que consiste en la SEC ID NO:11; (ii) un cebador que consiste en la SEC ID

NO:12; y una sonda que consiste en la SEC ID NO:17 que en el extremo 5’ tiene 6-carboxifluoresceína y en el 10 extremo 3’ tiene un extintor no fluorescente.

4. Un kit que comprende (i) un cebador que consiste en la SEC ID NO:11; (ii) un cebador que consiste en la SEC ID NO:12; y una sonda que consiste en la SEC ID NO:53.

5. Un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de MAGE-A3 en tejido tumoral Fijado en Formol e Incluido en Parafina (FFPE) , que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada

obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPE con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO:11 y SEC ID NO:12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2.

6. Un procedimiento de diagnóstico en pacientes que comprende la etapa de poner en contacto una secuencia de nucleótidos aislada obtenida o derivada de una muestra de tejido tumoral FFPE con un conjunto de cebadores que consiste en la SEC ID NO:11 y SEC ID NO:12 y una sonda de acuerdo con la reivindicación 2 y evaluar si MAGE-A3

se expresa en la muestra.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 ó 6, que adicionalmente comprende la etapa de amplificar una secuencia de nucleótidos y detectar en la muestra la secuencia de nucleótidos amplificada.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, que adicionalmente comprende la etapa de determinar si la secuencia de

nucleótidos se hibrida, en condiciones rigurosas, con el cebador o con la sonda, detectando de este modo si el tejido 25 tumoral es positivo a MAGE-A3.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, que adicionalmente comprende la etapa de usar la hibridación in situ para detectar si la secuencia de nucleótidos se hibrida al menos con un cebador o con una sonda.

FIG. 9

Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión del fragmento de Proteína D, fragmento Mage3, y cola de histidina, y su secuencia de aminoácidos respectiva (SEC ID

FIG. 10

Proteína de fusión de NS1-MAGE3, y cola de Histidina (SEC ID Nº:37)

FIG. 11

ADN que codifica la proteína de fusión NS1-MAGE3-His (SEC ID Nº:38)

FIG. 12

Proteína de fusión de CLYTA -MAGE3 -Histidina (SEC ID Nº:39)

FIG. 13

ADN de la proteína de fusión CLYTA-MAGE3-His (SEC ID Nº:40)

FIG. 15

Comparación de MAGE-A3 (SEC ID Nº:51) y MAGE-A6 (SEC ID Nº:52)

96, 4 %

Tampón RBC