Un procedimiento para la detección y/o la tipificación del Virus del Papiloma Humano (HPV) presente en una muestra biológica,

procedimiento que comprende las etapas de:

(i) amplificación de un fragmento de ácido polinucleico que comprende los nucleótidos 6566-6596 de la secuencia de referencia del HPV 5 16 K02718 (o K02718.1) que tiene la secuencia 5' TTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAAT3' o región equivalente de otros tipos de HPV (Región B) de la muestra mediante el uso de:

- un cebador 5' que se hibrida específicamente con la región "A" del genoma del HPV 16 o región equivalente de otro genoma del HPV, estando dicha región "A" indicada en la Figura 1 y siendo la región A de la secuencia de referencia 5' GATGCCCAAATATTCAATAAACC 3';

- un cebador 3' que se hibrida específicamente con la región "C" del genoma de al menos un tipo de HPV, estando dicha región "C" indicada en la Figura 1 y siendo la región C de la secuencia de referencia 5' AATGGCATTTGTTGGGGTAACCA 3'.

(ii) hibridación de los fragmentos amplificados de la etapa (i) con al menos una sonda capaz de hibridarse específicamente con los nucleótidos 6566-6596 de la secuencia de referencia del HPV 16 K02718 (o K02718.1) o región equivalente de otros tipos de HPV.

Procedimiento para la detección del HPV, y sondas, cebadores y kits Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la detección e identificación de infecciones provocadas por el Virus del Papiloma Humano (HPV) .

Antecedentes de la invención

El cáncer de cuello uterino es el segundo tumor maligno más común en mujeres después del cáncer de mama. El carcinoma del cuello uterino es único en cuanto a que es el primer tumor sólido principal en el que se encuentra ADN del HPV en casi todos los casos y en las lesiones precursoras a nivel mundial.

Se han caracterizado más de 100 tipos de HPV y se enumeran por orden cronológico del aislamiento. El HPV es epiteliotrópico e infecta únicamente la piel (tipos cutáneos) o la mucosa del tracto respiratorio y anogenital (tipos mucosos) . Se conocen más de 40 tipos de HPV que infectan el cuello uterino. En base a las lesiones benignas, premalignas o malignas provocadas, el HPV se divide en tipos de bajo riesgo (p. ej., tipos 6, 11, 42, 43 y 44 del HPV) y tipos de alto riesgo (p. ej., tipos 16, 18, 31, 33 y 45) , respectivamente. Los tipos de alto riesgo son responsables de más del 99% de todos los cánceres de cuello uterino invasivos. Por consiguiente, la detección e identificación de los tipos de HPV es muy importante. Los tipos de alto riesgo se encuentran por definición sistemáticamente en las LIE (Lesiones Intraepiteliales Escamosas) de alto grado y en carcinomas in situ, mientras que los tipos de bajo riesgo se encuentran principalmente en LIE de bajo grado. Esta observación epidemiológica se basa en descubrimientos moleculares. Por ejemplo, las proteínas E6 y E7 de los tipos de bajo riesgo 6 y 11 se unen a p53 y pRB demasiado débilmente para inmortalizar los queratinocitos in vitro o para provocar la transformación maligna in vivo (Woodworth et al., 1990) . El genoma de ADN bicatenario circular de los tipos de HPV de bajo riesgo sigue siendo episomal, mientras que el genoma de los tipos de HPV de alto riego es capaz de integrarse en el genoma humano.

El rastreo de los trastornos malignos y premalignos del cuello uterino se realiza habitualmente según el sistema de Papanicoloau (PAP) . Se examinan frotis cervicales mediante microscopía luminosa y las muestras que contienen células morfológicamente anormales se clasifican como PAP I a V, en orden ascendente de gravedad de la lesión. El procedimiento citomorfológico es un procedimiento indirecto y mide el posible resultado de una infección por HPV. Por lo tanto, la detección y tipificación del ADN del HPV es importante en el rastreo secundario para seleccionar pacientes para su control (seguimiento) y tratamiento. Esto significa que los frotis cervicales clasificados como PAP II (metaplasia escamosa atípica) o clases superiores se han de analizar en busca de los tipos de HPV de bajo riesgo y de alto riesgo. Los estudios de seguimiento han demostrado que sólo los tipos de HPV de alto riesgo están implicados en la progresión de las células de cuello uterino citológicamente normales hacia las LIE de alto grado (Remminck et al., 1995) . Estos resultados indican que la presencia de los tipos de HPV de alto riesgo es un marcador de pronóstico del desarrollo y la detección del cáncer de cuello uterino.

El diagnóstico del HPV mediante cultivo no es posible. Además, el diagnóstico mediante la detección de los anticuerpos contra el HPV parece estar dificultada por una sensibilidad y una especificidad insuficientes. Los procedimientos directos para diagnosticar una infección por HPV se basan principalmente en la detección del genoma del ADN viral mediante diferentes formatos de hibridación de ADN/ADN o ARN/ADN con o sin una amplificación previa del ADN de HPV. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento que es muy eficiente para la amplificación de cantidades mínimas de ADN diana. Actualmente, se usan principalmente tres pares de cebadores diferentes para la amplificación universal del ADN del HPV ("cebadores de amplio espectro") . Tres de estos pares de cebadores, MY11/MY09, GP5/GP6 y el sistema SPF10, se dirigen hacia regiones conservadas entre los diferentes tipos de HPV de la región LI (Manos et al., 1989; Van den Brule et al., 1990, WO9914377) . También se usa el sistema PGMY, una modificación del MY09/11 (véase Gravitt, P., 2000. "Improved amplification of genital human papillomaviruses". J. Clin. Microbiol. 38:357-361) . Otro par de cebadores, CPl/CPllg, se dirige a regiones conservadas de la región E1 (Tieben et al., 1993) , pero CPI/II no se usa habitualmente.

Hay varios procedimientos para identificar los diversos tipos de HPV.

El ADN del HPV se puede tipificar mediante cebadores de PCR que sólo reconocen un tipo específico. Este procedimiento se conoce como PCR específica de tipo. Dichos procedimientos se han descrito para los tipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31 y 33 (Claas et al., 1989; Cornelissen et al., 1989; Falcinelli et al., 1992; Van den Brule et al., 1990; Young et al., 1989) . Los cebadores se dirigen a las regiones E5, L1, E6, L1, E2 y E1 del genoma del HPV para los tipos 6, 11, 16, 18, 31 y 33, respectivamente (Baay et al., 1996) .

Otro procedimiento es la amplificación general de una parte genómica de todos los tipos de HPV seguida de la hibridación con dos cócteles de sondas específicas de tipo que diferencian entre los grupos oncogénicos y no oncogénicos, respectivamente. Se ha descrito un procedimiento de tipificación similar descrito sin amplificación previa del ADN del HPV. En el ensayo de captura de híbridos (Hybrid Capture Sharp Assay; Digene, Silver Springs, MD) , se analiza cada muestra para un grupo de tipos de HPV de "alto riesgo" (p.ej., 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y para otro grupo de tipos de VHP de "bajo riesgo" (p.ej., 6, 11, 42, 43 y 44) (Cox et al., 1995) .

Un sistema de detección y tipificación revelado en el documento WO9914377 utiliza una etapa de amplificación por PCR y una hibridación de transferencia inversa de líneas con sondas específicas de tipo.

En la actualidad, la clasificación formal del virus del papiloma humano se basa en el análisis secuencial de un fragmento de 291 pb de la región L1 (Chan et al. J Virol., mayo de 1995; 69 (5) :3074-83, DeVilliers et al., Virology., 20 de junio de 2004; 324 (1) :17-27) . El análisis filogenético de estas secuencias permite la clasificación de los diferentes tipos de HPV. Por definición, si la diferencia secuencial en esta región entre dos aislados de HPV es mayor del 10%, se clasifican como tipos diferentes. Por consiguiente, si la secuencia difiere en más del 10% de cualquier tipo de HPV conocido, se clasifica como un nuevo tipo de HPV. Los aislados de HPV que difieren entre 2-10% se clasifican como subtipos diferentes. Finalmente, si la variación secuencial es inferior al 2%, los 2 aislados se clasifican dentro del mismo subtipo como variantes diferentes.

El documento W099/14377 revela un procedimiento para la detección del HPV en una muestra biológica.

Todavía existe la necesidad de mejores sistemas de detección y tipificación.

Descripción de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para tipificar cualquier ácido nucleico del HPV que pueda estar presente en una muestra, procedimiento que comprende las etapas de poner en contacto cualquiera de dichos ácidos nucleicos con al menos una sonda capaz de hibridarse específicamente con la región B del HPV, estando dicha región indicada en la Figura 1, y luego analizar el/los tipo/s de HPV en base al resultado de la hibridación así obtenido.

La invención se refiere además a un procedimiento en el que se lleva a cabo una etapa de amplificación para amplificar cualquier ácido nucleico del HPV que pueda estar presente en una muestra biológica antes de la etapa de hibridación.

Como tal, la invención se refiere a un procedimiento para la detección y/o la tipificación de cualquier ácido nucleico del HPV que pueda estar presente en una muestra biológica, procedimiento que comprende las etapas de:

(i) amplificar un fragmento de ácido polinucleico que comprende la región B de cualquier ácido nucleico del HPV de la muestra, estando dicha región B indicada en la Figura 1, y

(ii) poner en contacto cualquiera de los fragmentos amplificados de la etapa (i) con al menos una sonda capaz de hibridarse específicamente con la región B del HPV, estando dicha región B indicada en la Figura 1.

La invención también se refiere a un procedimiento para la detección y/o la tipificación del HPV que pueda estar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección y/o la tipificación del Virus del Papiloma Humano (HPV) presente en una muestra biológica, procedimiento que comprende las etapas de:

(i) amplificación de un fragmento de ácido polinucleico que comprende los nucleótidos 6566-6596 de la secuencia de referencia del HPV 16 K02718 (o K02718.1) que tiene la secuencia 5' TTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAAT3' o región equivalente de otros tipos de HPV (Región B) de la muestra mediante el uso de:

- un cebador 5' que se hibrida específicamente con la región "A" del genoma del HPV 16 o región equivalente de otro genoma del HPV, estando dicha región "A" indicada en la Figura 1 y siendo la región A de la secuencia de referencia 5' GATGCCCAAATATTCAATAAACC 3';

- un cebador 3' que se hibrida específicamente con la región "C" del genoma de al menos un tipo de HPV, estando dicha región "C" indicada en la Figura 1 y siendo la región C de la secuencia de referencia 5' AATGGCATTTGTTGGGGTAACCA 3'.

(ii) hibridación de los fragmentos amplificados de la etapa (i) con al menos una sonda capaz de hibridarse específicamente con los nucleótidos 6566-6596 de la secuencia de referencia del HPV 16 K02718 (o K02718.1) o región equivalente de otros tipos de HPV.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la sonda es capaz de hibridarse específicamente con la región B del genoma de un solo tipo de HPV.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 que hibrida los fragmentos amplificados de fragmentos de ácido polinucleico de la etapa (i) con una pluralidad de sondas que comprenden los nucleótidos 6566-6596 con referencia a la secuencia de HPV 16 con número de acceso del banco de genes K02718.1 o las posiciones equivalentes a los mismos de otras secuencias del HPV, en el que cada sonda es capaz de hibridarse específicamente con un genoma de un solo tipo de HPV.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que la sonda se selecciona de la enumeración que consiste en las secuencias enumeradas en las Tablas 4, 5-14, 17, 18, 19.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa de amplificación usa un cebador seleccionado de la enumeración que comprende: HPV-MPF1F1 (SEC ID Nº 1) , HPV-MPF1F2 (SEC ID Nº 2) , HPV-MPF1F3 (SEC ID Nº 3) , HPV- MPF1F4 (SEC ID Nº 4) , HPV-MPF1F5 (SEC ID Nº 5) , HPV-MPF1F6 (SEC ID Nº 6) , HPV-MPF1F7 (SEC ID Nº 7) , HPV-MPF1F8 (SEC ID Nº 8) , HPV-MPF1F9 (SEC ID Nº 9) , HPV-MPF1F10 (SEC ID Nº 10) , HPV-MPF2R1 (SEC ID Nº 11) , HPV-MPF2R2 (SEC ID Nº 12) , HPV-MPF2R3 (SEC ID Nº 13) , HPV-MPF2R4 (SEC ID Nº 14) , HPV-MPF2R5 (SEC ID Nº 15) , HPV-MPF2R6 (SEC ID Nº 16) , HPV-MPF2R7 (SEC ID Nº 17) , HPV-MPF2R8 (SEC ID Nº 18) .

6. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior en el que se confirma la presencia de ácido nucleico del HPV en la muestra antes de la etapa de tipificación.

7. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior en el que la hibridación entre la sonda y la diana se lleva a cabo en presencia de un soporte sólido.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la etapa de hibridación usa un formato de hibridación inversa.

9. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la sonda se une directa o indirectamente sobre una perla, opcionalmente, una perla fluorescente.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que se analiza la detección de la hibridación usando citometría de flujo.

11. Un kit que comprende un conjunto de cebadores directos e inversos y una tercera sonda de tipificación de oligonucleótido capaz de hibridarse con la región 6566-6595 de la secuencia de referencia del HPV 16 K02718 según lo definido la reivindicación 1 o región equivalente de otros tipos de HPV (región B) , en el que los cebadores se seleccionan de la enumeración que consiste en HPV-MPF1F1 (SEC ID Nº 1) , HPV-MPF1F2 (SEC ID Nº 2) , HPV-MPF1F3 (SEC ID Nº 3) , HPV-MPF1F4 (SEC ID Nº 4) , HPV-MPF1F5 (SEC ID Nº 5) , HPV-MPF1F6 (SEC ID Nº 6) , HPV-MPF1F7 (SEC ID Nº 7) , HPV-MPF1F8 (SEC ID Nº 8) , HPV- MPF1F9 (SEC ID Nº 9) , HPV-MPF1F10 (SEC ID Nº 10) , HPV-MPF2R1 (SEC ID Nº 11) , HPV-MPF2R2 (SEC ID Nº 12) , HPV-MPF2R3 (SEC ID Nº 13) , HPV-MPF2R4 (SEC ID Nº 14) , HPV-MPF2R5 (SEC ID Nº 15) , HPV- MPF2R6 (SEC ID Nº 16) , HPV-MPF2R7 (SEC ID Nº 17) , HPV-MPF2R8 (SEC ID Nº 18) .

12. Un kit que comprende al menos 2 sondas capaces de hibridarse específicamente con la región B del genoma del HPV.

13. Un kit según la reivindicación 12, en el que las sondas son dos sondas cualquiera seleccionadas de cualquiera de

las Tablas 4, 5-14, 17, 18, 19.

14. Un kit según la reivindicación 13 que comprende un par de cebadores directo e inverso de la Tabla 1 ó 2.

15. Un kit según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 que comprende además una sonda de la Tabla 3.