PROCEDIMIENTO PARA LA AMIDACIÓN DE POLIPÉPTIDOS CON AMINOÁCIDOS BÁSICOS C-TERMINALES UTILIZANDO ENDOPROTEASAS ESPECÍFICAS.

Procedimiento para la fabricación de péptidos di o polibásicos amidados C-terminales de la fórmula general I en la que (AS)-X-NH2 (I) AS significa un péptido caracterizado por la secuencia o y   HGEGGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2 (SEQ ID Nº 1) HGEGTFTSDL SKWMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2 (SEQ ID Nº 4) X significa lisina o arginina;

en la que un péptido caracterizado por la secuencia HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK (SEQ ID Nº 7) se hace reaccionar con N-Arg-NH2 o H-Lys-NH2 en presencia de una enzima con la actividad biológica de tripsina, en la que la enzima tiene la capacidad de disociar un enlace de péptido C-terminal en aminoácidos básicos y, dado el caso, el compuesto obtenido de la fórmula I es purificado según la química de proteínas

Procedimiento para la amidación de polipéptidos con aminoácidos básicos C-terminales utilizando endoproteasas específicas La presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de péptidos di o polibásicos amidados Cterminales, en particular aquéllos con la actividad biológica de GPL-1 y sus análogos o derivados.

La estabilidad, la disponibilidad biomédica y la duración de la actuación de péptidos y proteínas relevantes desde el punto de vista farmacéutico dependen en gran medida de la naturaleza del extremo N-terminal o bien C-terminal de la molécula. El semiperiodo de vida de biomoléculas está influenciado claramente por prolongación C-terminal en aminoácidos básicos. Se pueden conseguir actividades farmacéuticas especialmente buenas cuando en la prolongación C-terminal en más de un aminoácido básico, el aminoácido C-terminal extremo en un aminoácido amida.

La fabricación de tales sustancias activas a base de péptido, cuando los péptidos son suficientemente pequeños, se puede realizar directamente a través de una síntesis química completa de acuerdo con un protocolo de síntesis de Merrifield modificado. No obstante, resultan limitaciones cuando se necesita tal péptido en grandes cantidades. Así, por ejemplo, los aminoácidos que deben emplearse en la síntesis deben fabricarse en primer lugar y purificarse, para que sean adecuados a continuación después de modificación química en la síntesis del péptido como reactivos. Después de la eliminación de los grupos de protección al término de la síntesis, el péptido objetivo o bien el producto se puede purificar entonces y formular como producto farmacéutico. De acuerdo con la composición del péptido se pueden producir, además, durante la síntesis a través de efectos de proximidad rendimientos limitados, racemización o formación de productos secundarios debido a copulación deficiente en etapas de copulación individuales, con lo que se puede influir negativamente sobre el rendimiento total o la pureza del producto. Para la fabricación de cantidades mayores de sustancia valiosa, la síntesis total es demasiado costosa. Por lo tanto, sería deseable la fabricación a través de procedimientos alternativos, en particular biotécnicos.

Desde hace mucho tiempo se conocen enzimas que están en condiciones de amidar péptidos C-terminales. Estas enzimas llevan el nombre (Eipper y col. Mol. Endocrinol. Nov. 1987; 1 (11) : 777) de enzimas de alfa-amidación de peptidilglicina (Peptidylglycine-alpha-amidating-enzyme PAM) . La fabricación y purificación de tales enzimas PAM son conocidas por el técnico y se describen en detalle (M. Nogudi y vol. Prot. Expr. Purif. 2003, 28: 293) . Pero la fabricación es intensiva de costes con respecto a la fabricación de otras enzimas técnicas, como por ejemplo, tripsina o carboxipeptidasa.

Resulta una alternativa a la amidación ‘in Vitro' por medio de PAM cuando se co-expresa la enzima con la proteína precursora a amidar en la misma célula huésped. Esto se consigue introduciendo una secuencia genética, que codifica una actividad PAM bajo el control de una secuencia de regulación específica del huésped en la célula huésped. Esta secuencia de expresión o bien puede estar incorporada de forma estable en la secuencia DNS crosomal respectiva o bien puede estar presente en un segundo plásmido paralelamente al plásmido de expresión para la proteína objetivo, o puede estar integrada como segunda casilla de expresión sobre el mismo vector, o puede estar clonada en un apéndice de expresión policistrónico en fase con la secuencia genética, que codifica la proteína objetivo bajo el control de la misma secuencia promotora. Sin embargo, los rendimientos descritos son reducidos, de manera que solamente se puede conseguir la fabricación de cantidades mayores a través de volúmenes de fermentación correspondientes. Esto conduce a un gasto de purificación elevado intensivo de costes. Además, a amidación no se realiza cuantitativamente, de manera que la proteína valiosa amidada debe separarse de la proteína valiosa no amidada. Si se decide por un proceso de fabricación secretor (por ejemplo, Hong y col. Appl Biochem Biotechnol. 2003; 110, páginas 113-23) , es un inconveniente que proteínas con térmico C polibásico no son secretadas o solamente en una medida muy reducida.

Otro método para la amidación se basa en la utilización de mecanismos de auto-disociación específicos de la proteína (Nottingham y col. Nature Biotech. Vol. 19, 974-977, 2001) . Sin embargo, el control de esta reacción no es sencillo y se puede producir una transtioesterificación y, por lo tanto, la formación de productos no deseados.

Con respecto al rendimiento puede repercutir de manera desfavorable la porción relativamente grande de proteína de fusión.

Los procedimientos de amidación descritos anteriormente parten de un término C del péptido objetivo, prolongado en al menos un aminoácido glicina o de manera alternativa inteinpéptido. Pero los péptidos, que llevan C-terminal lisina, se pueden fabricar, cuando no contienen en el desarrollo siguiente de la secuencia ninguna lisina o arginina adicional, como estructura multímera, que se puede transformar a continuación a través de digestión con tripsina o enzimas similares a tripsina en el módulo monómero. De esta manera, se pueden conseguir rendimientos altos. Esto no es posible en el caso de los procedimientos descritos anteriormente.

Por lo tanto, los procedimientos de fabricación biotécnicos conocidos están unidos con inconvenientes y el cometido de fabricar péptidos o proteínas, que llenan en el término C más que un aminoácido básico lisina o arginina y están amidados en el término, en grandes cantidades económicamente, no se puede considerar suficientemente resuelto.

Resultaría un procedimiento de fabricación alternativo si se consiguiese fabricar una fase previa del péptido objetivo, acortada al menos en un aminoácido básico, en grandes cantidades y prolongarla a continuación en una semisíntesis catalizada con enzima con lisinamida o bien argininamida.

Levin y col. (Biochemical Hournal 63:308-16; 1856) describen la actuación de tripsina sobre lisinamida y diferentes poli-péptidos de lisinamida. Los resultados de los autores muestran que derivados de lisinamida bajo la influencia de tripsina no se pueden convertir en derivados de lisinamida de elevado peso molecular, puesto que la hidrólisis de las amidas formadas intermediarias en el ácido libre se realiza rápidamente en comparación con la reacción de copulación. De ello debe deducirse que los procedimientos semi-sintéticos catalizados con tripsina, que prevén la fabricación de péptidos con poli-lisinamida C-terminal o poli-arginamida o secuencias mixtas poli-Lys/Arg, no tienen éxito o solamente con rendimientos reducidos.

Ahora se ha encontrado un procedimiento químico de péptidos, que permite de manera sorprendente con altos rendimientos (es decir, > 30 %) la ligación catalizada con tripsina de aminoácidos básicos amidados, sus análogos o derivados, a péptidos, que presentan un aminoácido básico C-termina.

Además, se ha podido observar de manera sorprendente para el procedimiento de acuerdo con la invención que la introducción de grupos protectores (ver Pitraschke y col. Tetrahedron: Asymmetr y 9. páginas 105 – 518) , como por ejemplo –Boc (t-butiloxicarbonilo) , -Z (Benziloxicarbonilo) o –DDZ (dimetilfenilpropiloxi-carbonilo) en los aminoácidos básicos amidados (lisinamida, argininamida) no conduce a una mejora de la reacción de ligación con respecto a la eficiencia y selectividad. Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la invención ofrece la ventaja de que se puede prescindir del enmascaramiento con grupos protectores, con lo que se evitan pérdidas de rendimiento a través de la eliminación del grupo protector y la evacuación de reactivos tóxicos. De ello se deducen enormes ventajas de costes del procedimiento frente a la síntesis química total.

Thorkildsen y col. (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 307, Nº 2, 490-496, 2003) describen que el agonista ZP10A del receptor “Glucagon-Like Peptide 1” refuerza la expression de insulina mRNA e impide la progresión de diabetes en ratones db/db.

En la patente europea Nº 0 490 249 se describe un procedimiento para la fabricación de Growth Hormone Releasing Factor GRF (1-44) -NH2, en el que se hace reaccionar GRG (1-43) -OH con Leu-NH2 en presencia de tripsina.

Schellenberger y col.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la fabricación de péptidos di o polibásicos amidados C-terminales de la fórmula general I (AS) -X-NH2 (I)

en la que

en la que un péptido caracterizado por la secuencia HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK

(SEQ ID Nº 7)

se hace reaccionar con N-Arg-NH2 o H-Lys-NH2 en presencia de una enzima con la actividad biológica de tripsina, en la que la enzima tiene la capacidad de disociar un enlace de péptido C-terminal en aminoácidos básicos y, dado el caso, el compuesto obtenido de la fórmula I es purificado según la química de proteínas.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en el caso de la fabricación del péptido caracterizado por la secuencia SEQ ID Nº 1, la relación molar del péptido caracterizado por la secuencia SEQ ID Nº 7 y H-Lys-NH2 es 1 : 144 y en el caso de la fabricación del péptido caracterizado por la secuencia SEQ ID Nº 4, la relación molar del péptido caracterizado por la secuencia SEQ ID Nº 7 y H-Arg-NH2 es 1 : 585.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que a) se expresa un péptido de fusión, que contiene un péptido caracterizado por la secuencia ID Nº 7;

b) el péptido caracterizado por la secuencia ID Nº 7 es liberado por medio de disociación enzimática de dicho péptido de fusión;

c) el producto intermedio de la etapa b) , dado el caso después de purificación según la química de proteínas, se hace reaccionar, en presencia de una enzima con la actividad biológica de tripsina con H-Lys-NH2 o H-Arg-NH2; y d) dado el caso, el compuesto obtenido de péptidos caracterizado por las secuencias SEQ ID Nº 1 ó 4 de la fórmula I es purificado según la química de proteínas y aislado.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la disociación desde la proteína de fusión se realiza por medio de enteroquinasa, Factor Xa, genenasa, trombina o tripsina.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la proteína de fusión se expresa en un sistema de expresión seleccionado a partir del grupo que contiene E. coli, S. carnosus, Salmonella, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens. K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe y S. cerevisiae.