INMUNOENSAYOS PARA LA DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE ISOFORMAS DE SCCA.

Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une selectivamente sólo a moléculas del antígeno 2 de carcinoma de células escamosas (SCCA2),

excluyendo las moléculas de SCCA2 en complejo, con una reactividad cruzada de

Inmunoensayos para la determinacion especifica de isoformas de SCCA

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a la determinacion especifica de diferentes isoformas de SCCA y al uso de la 5 concentracion serologica de las diferentes isoformas y proporcion entre ellas como un medio de diagnostico del cancer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El antigeno de carcinoma de celulas escamosas (SCCA) es un marcador serologico para los carcinomas de celulas escamosas (SCC) del utero, cuello del utero, pulmon, cabeza y cuello, vulva y esofago (1, 2) . Lo purificaron originalmente al final de la decada de los 70 Kato y colaboradores a partir del complejo TA del carcinoma de celulas escamosas del cuello del utero humano con un peso molecular de 42448 kDa (1, 3) . La electroforesis del complejo TA revelo mas de 10 fracciones y el isoelectroenfoque del antigeno sugirio dos subfracciones, una isoforma acida (pI<6, 25) y una neutra (pI≥6, 25) (4) .

La clonacion del ADNc de SCCA muestra que pertenece a la familia de los inhibidores de serina proteasas (serpinas) (6) . La clonacion adicional de la region genomica del cromosoma 18q21.3 revelo dos genes dispuestos en tandem (7) . El mas telomerico, el SCCA original, se designo SCCA1, mientras que el mas centromerico se designo SCCA2 (Figura 1) . Ambos contienen ocho exones y los limites intron4exon, sitios de corte y empalme, codones de inicio y codones terminales potenciales son identicos. Son identicos en un 98% a nivel de nucleotidos e identicos en un 92% a nivel de aminoacidos. Los valores de pI deducidos de los productos genicos SCCA1 y SCCA2 muestran que la isoforma neutra esta codificada por SCCA1 y la isoforma acida por SCCA2.

En los seres humanos las serpinas se localizan en uno de dos grupos cromosomicos. PI6, PI9 y ELNAH2 se localizan en 6p25, mientras que PIB, Bomapina, PAI2, SCCA1, SCCA2, Headpin y Maspina se localizan en 18q21.3 (Figura 1) (7412) . Se supone que estos grupos han surgido a traves de dos duplicaciones intercromosomicas independientes y varios ciclos de duplicaciones intracromosomicas (9) . Se ha publicado frecuentemente que la region cromosomica 18q es una region con una frecuencia alta de reorganizaciones (9, 13416) . Las dianas y funciones de las serpinas no se entienden completamente. Para la mayor parte, las funciones principales son la regulacion de eventos proteoliticos asociados con la coagulacion, fibrinolisis, apoptosis e inflamacion, aunque se han publicado funciones alternativas tales como regulacion del transporte de hormonas y de la presion sanguinea (17424) .

Aunque SCCA1 y SCCA2 son casi identicas, se diferencian en sus bucles de sitio reactivo (Figura 2 y 3) . SCCA1 inhibe las cisteina proteinasas semejantes a papaina catepsina S, K y L (25. 26) mientras que SCCA2 inhibe las serina proteinasas semejantes a quimiotripsina catepsina G y quimasa de mastocitos (27) . Los estudios sobre el bucle del sitio reactivo (RSL) de SCCA1 muestran que RSL es esencial para la inhibicion de cisteina proteinasa (28) . La parte variable de RSL dicta la especificidad de las proteinasas diana mostrado por mutantes de intercambio de RSL de SCCA1 y SCCA2 y mutantes unicos (28, 29) . Es probable que las serpinas utilicen un mecanismo dependiente de RSL comun para inhibir tanto las serina como las cisteina proteinasas.

El papel biologico de SCCA1 y SCCA2 no se entiende completamente. Se considera que son serpinas inhibidoras. Los datos sugieren que SCCA estan implicadas en la apoptosis y la expresion hace que las celulas cancerosas sean resistentes a varios mecanismos de muerte por inhibicion de la apoptosis (30) .

SCCA1 y SCCA2 se detectan en el citoplasma de celulas epiteliales escamosas normales (31, 33) . El antigeno, que aparece en el suero de pacientes, puede ser una funcion de la superproduccion de SCCA por las celulas tumorales y su velocidad de recambio normal (34) . Se ha publicado que el SCCA detectado en el suero usando un ensayo de radioinmunologia con anticuerpo o PCR en tiempo real, RT4PCR, es principalmente SCCA2 (1, 35, 36) pero otros estudios usando PCR indican que ambos antigenos pueden amplificarse y detectarse en muestras de pacientes (37) .

Las concentraciones sericas en pacientes con SCC se correlacionan con el estadio clinico y con el grado de diferenciacion histologica del tumor (1) . Para el cancer del cuello del utero, varios estudios muestran una correlacion 45 entre los valores de pretratamiento y el resultado clinico (1, 38443) . Los estudios tambien muestran una correlacion entre niveles altos de SCCA y volumen tumoral. La recurrencia o enfermedad progresiva pudieron detectarse varios meses antes de la evidencia clinica (39) . Se observan resultados similares para carcinomas de celulas escamosas de pulmon, vulva, cabeza y cuello y esofago (1, 2, 44, 45) . En todos estos estudios, han medido el nivel total de SCCA. Por ejemplo, Cataltepe et al. (33) describen el desarrollo de anticuerpos monoclonales especificos y un ensayo discriminatorio 50 sensible para los marcadores tumorales circulantes SCCA1 y SCCA2. Sin embargo, los anticuerpos segun Cataltepe et al. (33) solo pueden usarse para la determinacion de SCCA1 o SCCA2 "total". Solo son utiles para la determinacion de

niveles altamente elevados de estas moleculas y por lo tanto no son adecuados para distinguir entre sujetos con cancer y sanos ni para la monitorizacion de la respuesta a terapia y deteccion de enfermedad recurrente.

Las SCCA pertenecen a la familia de las serpinas y es probable que diferentes formas de las serpinas puedan detectarse en tejidos y en la circulacion. La funcion general de las serpinas es regular la actividad de diferentes enzimas proteoliticas y puede especularse que SCCA1 y SCCA2 en tejidos y suero tambien pueden aparecer como la serpina "libre" y como un complejo con sus proteasas diana. Esto seria similar a la serina proteasa PSA que en el suero se encuentra principalmente como un complejo con la serpina alfa14antiquimotripsina. La determinacion especifica de SCCA1 y SCCA2 asi como la forma respectiva "libre" y en complejo de la serpina respectiva tambien puede proporcionar informacion clinica adicional comparada con SCCA "total".

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion describe el establecimiento de anticuerpos monoclonales capaces de distinguir entre SCCA1 y SCCA2 asi como entre la cantidad "libre" y "total" de la serpina respectiva. Ademas, la invencion describe el uso de los anticuerpos discriminatorios establecidos para el diseno de inmunoensayos para la determinacion de la forma total y "libre" de las serpinas SCCA1 y SCCA2, asi como el uso de los inmunoensayos para el diagnostico del cancer y la deteccion de enfermedad recurrente.

DESCRIPCION DE REALIZACIONES ESPECiFICAS

El establecimiento de anticuerpos monoclonales frente a epitopos de SCCA1 y SCCA2, asi como SCCA varios expuestos y escondidos en el complejo serina proteasa de las SCCA, respectivamente, hace posible disenar inmunoensayos especificos para la determinacion de la forma respectiva de SCCA. Ademas, en la presente invencion se describen metodos para el diagnostico del cancer usando los inmunoensayos especificos.

EJEMPLO 1

Produccion de SCCA recombinante 1.1 Clonacion de SCCA

Se prepararon ARNm de las lineas celulares Caski (cuello uterino) , C44I (cuello uterino) , A549 (pulmon) y RPMI2650 (faringe) usando el kit de Purificacion de ARNm Micro QuickPrep (Pharmacia) y se preparo el ADNc usando el kit de Sintesis de Primera Cadena de ADNc (Pharmacia) . Un fragmento de ADN de 1218 pb que engloba la secuencia codificadora de SCCA se amplifico por PCR en una reaccion de 100 μl que contiene 10 mM Tris4HCl pH 8, 85, 25 mM KCl, 5 mM (NH4) 2SO4, 2 mM MgSO4 (Boehringer) , 0, 2 mM dNTP (Pharmacia) , 10 μM SCCA 147F (las secuencias de ADN de todos los cebadores se muestran en la Tabla 1) , 10 μM SCCA 3914397B, 2 μl de ADNc y 2, 5 U de polimerasa Pow (Boehringer) . Despues de desnaturalizar las muestras durante 5 min a 960C, se realizo un total de 30 ciclos, consistiendo cada uno en desnaturalizacion durante 15 segundos a 960C, hibridacion durante 15 segundos a 600C y extension durante 30 segundos a 720C. La reaccion de PCR se completo con una extension final durante 10 min a 720C.

Deteccion de SCCA1 y SCCA2

La presencia de SCCA1 en los productos de PCR se detecto por escision con la enzima de restriccion SacII, lo que resulto en dos fragmentos, 245 y 973 pb, respectivamente, o por PCR especifica de SCCA1 usando los cebadores SCCA147Fy SCCA13234329B... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se une selectivamente solo a moleculas del antigeno 2 de carcinoma de celulas escamosas (SCCA2) , excluyendo las moleculas de SCCA2 en complejo, con una reactividad cruzada de <5% para SCCA2 en complejo o moleculas del antigeno 1 de carcinoma de celulas escamosas (SCCA1) , para uso en la deteccion de carcinoma de celulas escamosas o enfermedad recurrente de carcinoma de celulas escamosas.

2. Un anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo se ha producido por celulas de hibridoma, obteniendose dichas celulas de hibridoma de celulas del bazo de un mamifero que se han fusionado con celulas de mieloma.

3. Un metodo in vitro para detectar moleculas de SCCA2 en una muestra, caracterizadoºporque

4 anticuerpos monoclonales segun las reivindicaciones 1 y/o 2 que se unen selectivamente solo a moleculas de SCCA2 libres se ponen en contacto en una muestra; y 4 se compara el nivel de union de dichos anticuerpos monoclonales en dicha muestra con el nivel de union de los mismos anticuerpos monoclonales en una muestra normal; y 4 un nivel incrementado de union de los anticuerpos monoclonales en la muestra comparado con el nivel de union de los mismos anticuerpos monoclonales en la muestra normal indica una presencia de cancer de celulas escamosas o cancer recurrente de celulas escamosas en la muestra.

4. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del cuello del utero.

5. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de pulmon.

6. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del utero.

7. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas del esofago.

8. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de cabeza y cuello.

9. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el cancer de celulas escamosas es cancer de celulas escamosas de la vulva.

10. Uso del anticuerpo monoclonal segun las reivindicaciones 1 y/o 2 para la deteccion in vitro de moleculas de SCCA2 en una muestra.

11. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del cuello del utero.

12. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de pulmon.

13. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del utero.

14. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas del esofago.

15. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de cabeza y cuello.

16. Uso segun la reivindicacion 10, en el que la muestra es cancer de celulas escamosas de la vulva.

17. Uso del anticuerpo monoclonal segun las reivindicaciones 142 para la preparacion de un agente de diagnostico para la deteccion in vitro de moleculas de SCCA2 en una muestra.