Kit para la detección de un polipéptido diana seleccionado del grupo de A142,

A140 y una mezcla de los mismos que comprende

(i) un primer anticuerpo o combinación de anticuerpos que reconocen dicho polipéptido diana en el que el primer anticuerpo se dirige contra un epítopo ubicado dentro de los aminoácidos 1 a 16 de A140 y A142; en el que el primer anticuerpo está previamente unido a un soporte sólido; (ii) un segundo anticuerpo o combinación de anticuerpos que reconocen una región diferente del polipéptido diana de la región reconocida por el primer anticuerpo o combinación de anticuerpos (iii) un reactivo que muestra afinidad por el segundo anticuerpo, estando acoplado dicho reactivo a un primer miembro de un par de unión y (iv) un segundo miembro de un par de unión acoplado a un marcador fluorescente, luminiscente o enzimático, en el que el par de unión se selecciona del grupo que consiste en: hapteno y anticuerpo; antígeno y anticuerpo; biotina y avidina; biotina y estreptavidina; un análogo de biotina y avidina; un análogo de biotina y estreptavidina; azúcar y lectina; enzima y cofactor; ácido nucleico y ácido nucleico complementario y análogo de ácido nucleico y ácido nucleico complementario.

Inmunoensayos de alta sensibilidad y kits para la determinación de péptidos y proteínas de interés biológico.

Campo técnico La invención se refiere al campo de los inmunoensayos que permite la detección de péptidos y proteínas en muestras y que proporcionan una sensibilidad mayor que los ensayos del estado de la técnica. La invención también se refiere a kits que proporcionan los componentes necesarios para llevar a cabo dichos inmunoensayos.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad degenerativa progresiva del sistema nervioso central caracterizada por una pérdida de memoria progresiva y en aumento, seguida por la pérdida del control de las funciones corporales y de las extremidades y finalmente la muerte. Es con mucho la causa más común de demencia, afectando del 1 al 6% de la población de más de 65 años y entre el 10 y el 20% de la que tiene más de 80.

La EA se distingue de otros tipos de demencia por varias características patológicas, que incluyen la aparición progresiva en el cerebro de los pacientes de placas seniles en el espacio extracelular entre las neuronas. Las placas tienen núcleos centrales de depósitos de amiloide formados principalmente por fibrillas de un péptido de 40-42 aminoácidos denominado péptido 1 amiloide (A1) rodeado de neuritis degenerada y células de glía. Este péptido proviene del procesamiento proteolítico de una proteína precursora llamada proteína precursora de 1 amiloide (1APP) . La 1APP se encuentra en el organismo como diferentes isoformas derivadas del corte y empalme alternativo del transcrito primario del gen que codifica para 1APP. Estas isoformas son principalmente 1APP-695, 1APP-751 y 1APP-770, en las que las cifras se refieren al número de aminoácidos. El gen de 1APP se encuentra en los seres humanos en el cromosoma 21, cuya trisomía (síndrome de Down) da como resultado la sobreexpresión de la proteína y la aparición temprana de placas amiloides en el cerebro de los pacientes (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766) . 1APP es una proteína transmembrana que puede procesarse por distintas enzimas proteolíticas (secretasas) para dar lugar a diferentes productos. Normalmente, 1APP se somete a escisión por la alpha secretasa en su región extracelular para generar un fragmento secretado largo y soluble y un fragmento más corto anclado a la membrana llamado C83, que se escinde adicionalmente por la y-secretasa para producir el péptido p3 (p340 o p342) y un péptido 57 ó 59 que se degrada adicionalmente por otras proteasas. Cuando 1-secretasa escinde la 1APP, da como resultado un fragmento secretado soluble (s1APP-1) y un fragmento C99 que puede escindirse por la ysecretasa para producir el péptido amiloide A1 y un péptido de 57 ó 59 aminoácidos anclado en la membrana (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766) .

La EA puede clasificarse según la edad de aparición como de inicio temprano (edad menor de 60 años) y de inicio tardío (edad de más de 60 años) , según la existencia de una herencia autosómica dominante, como EA familiar o EA esporádica. El inicio temprano de las formas familiares de la EA puede asociarse a mutaciones conocidas en los genes que codifican para la 1APP, presenilina 1 y presenilina 2 (ubicados, respectivamente, en los cromosomas 21, 14 y 2) . Estas clasificaciones no son mutuamente excluyentes. Las formas más frecuentes son formas esporádicas de inicio tardío.

En la práctica clínica, el diagnóstico de la EA se lleva a cabo usando criterios clínicos basados en la presencia de marcas clínicas típicas y en la exclusión de otros tipos de demencia usando técnicas de obtención de neuroimagen y análisis de sangre. Usando estos criterios, la fiabilidad del diagnóstico es aceptable aunque, según estudios realizados usando autopsia de cerebro, entre el 10-20% de los pacientes diagnosticados con EA padecían una enfermedad diferente. Además, los métodos de diagnóstico actuales sólo pueden llevarse a cabo cuando el proceso neurodegenerativo está tan avanzado que el paciente padece demencia grave y los daños cerebrales son tan extensos que el número de medidas terapéuticas está limitado. El diagnóstico definitivo requiere el examen patológico de tejido cerebral cadavérico.

Por tanto, existe una necesidad de identificar marcadores biológicos para el diagnóstico temprano de la EA que sean sensibles y específicos y que permitan distinguir el deterioro cognitivo debido a la edad de los asociados con los primeros síntomas del proceso, así como para distinguir cambio debidos a la EA y debidos a otros estados degenerativos. Según Growdon et al., (Neurobiol. Aging 1998, 19: 109-116) , el marcador ideal para la EA debe satisfacer los siguientes requisitos:

- Debe detectar una característica fundamental de la neuropatología

- Debe estar validado en casos de la enfermedad confirmados neuropatológicamente

- Debe mostrar un sensibilidad de al menos el 80% para detectar la EA

- Debe mostrar una especificidad de al menos el 80% para distinguir la EA de otros tipos de demencia y

- Debe ser fiable, reproducible, no invasivo, sencillo de realizar y económico.

En el estado de la técnica se conocen métodos para diagnosticar la EA detectando los niveles de marcadores biológicos presentes en el cerebro o el LCR de pacientes. Se han caracterizado diferentes marcadores biológicos cuya determinación se lleva a cabo en LCR. El LCR refleja directamente la composición del espacio extracelular del sistema nervioso central y por tanto, proporciona concentraciones más altas como marcadores biológicos. Sin embargo, el LCR solo se puede recuperar mediante punción lumbar, que no es un método de diagnóstico rutinario aceptado fácilmente por los pacientes que padecen demencia, por no mencionar los pacientes con trastornos de memoria. Por tanto, hay una necesidad de marcadores biológicos de EA que puedan detectarse en muestras que puedan recuperarse de forma no invasiva del cuerpo.

Los marcadores biológicos adecuados para la EA descritos en el estado de la técnica y que pueden detectarse en plasma incluyen (i) marcadores derivados de la placa amiloide, (ii) autoanticuerpos contra A1 o 1APP, (iii) marcadores inflamatorios tales como IL-6, su receptor o gp130, la proteína C reactiva o moléculas del estrés oxidativo (isoprostanos) , (iv) marcadores del metabolismo lipídico (apoE, oxiesteroles) y (v) marcadores de enfermedad vascular (homocisteína, lipoproteína b Clq) (Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2, 864-870) .

Sin embargo, en vista del hecho que A1 se acumula en el cerebro de pacientes con EA y es un elemento central en la patogenia de la EA, esta proteína se ha considerado como el candidato más adecuado como marcador biológico de la EA. Sin embargo, el uso de A1 como marcador biológico en plasma para la EA se enfrenta al problema de que las concentraciones de los péptidos A1 (A1 (1-40) y A1 (1-42) ) en suero son extremadamente bajas, de modo que no hay ensayos que sean lo suficientemente sensibles para permitir un detección fiable de dichas especies de péptidos.

Scheuner et al. (Nature Med., 1996, 2: 864-870) realizaron un estudio preliminar para detectar si las concentraciones extracelulares de presenilina-1, presenilina-2 o 1APP estaban aumentadas en pacientes de familias que portaban mutaciones asociadas a la EA familiar. Aunque se observaron niveles elevados de A11-42 (43) en el plasma de sujetos con mutaciones PS1 (P<0, 0001) , PS2N141I (P=0, 009) , APPK670N, M671L (P<0, 0001) , y APPV7171 (un sujeto) relacionadas con EAF (enfermedad de Alzheimer familiar) , estos estudios no se validaron para analizar la EA esporádica, en la que las concentraciones de los péptidos A1 en suero son mucho más bajas. El kit de ensayo usado en este documento es el ensayo de ELISA de tipo sándwich descrito previamente por Suzuki, N. et al. (Science, 1994, 264: 1336-1340) , que usa un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa.

Se ha sugerido que no hay correlación entre los niveles de A1 y la EA esporádica. De acuerdo con esto, Tamaoka, A et al. (J. Neurol. Sci., 1996, 141: 65-68) midieron los niveles de A1 en el plasma de 28 pacientes con EA esporádica, 40 pacientes con procesos neurológicos diferentes con demencia y 40 controles sanos. Los autores concluyeron que los niveles en plasma de A140 y A142 son similares en los sujetos control y los pacientes que padecen EA esporádica. Resultados similares se obtuvieron por Kosaka et al. (Neurology, (1997) 48, 741-745) . El ensayo usado por Tamaoka y colaboradores se ha caracterizado adicionalmente en el documento... [Seguir leyendo]

1. Kit para la detección de un polipéptido diana seleccionado del grupo de A142, A140 y una mezcla de los mismos que comprende

(i) un primer anticuerpo o combinación de anticuerpos que reconocen dicho polipéptido diana en el que el primer anticuerpo se dirige contra un epítopo ubicado dentro de los aminoácidos 1 a 16 de A140 y A142; en el que el primer anticuerpo está previamente unido a un soporte sólido;

(ii) un segundo anticuerpo o combinación de anticuerpos que reconocen una región diferente del polipéptido diana de la región reconocida por el primer anticuerpo o combinación de anticuerpos

(iii) un reactivo que muestra afinidad por el segundo anticuerpo, estando acoplado dicho reactivo a un primer miembro de un par de unión y (iv) un segundo miembro de un par de unión acoplado a un marcador fluorescente, luminiscente o enzimático, en el que el par de unión se selecciona del grupo que consiste en: hapteno y anticuerpo; antígeno y anticuerpo; biotina y avidina; biotina y estreptavidina; un análogo de biotina y avidina; un análogo de biotina y estreptavidina; azúcar y lectina; enzima y cofactor; ácido nucleico y ácido nucleico complementario y análogo de ácido nucleico y ácido nucleico complementario.

2. Kit según la reivindicación 1, que se ha tratado con una disolución concentrada de trehalosa y se ha dejado secar.

3. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además una muestra que contiene los péptidos A140 y/o A142.

4. Kit según las reivindicaciones 1 a 3, en el que, si el segundo miembro del par de unión está acoplado a un marcador enzimático, entonces el kit comprende además un sustrato que puede convertirse por dicha enzima en un producto detectable.

5. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para determinar o detectar un polipéptido en una muestra, en el que el polipéptido diana que va a determinarse o detectarse se selecciona del grupo de A140, A142 o una mezcla de los mismos.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que la muestra se selecciona del grupo de sangre, plasma, suero o LCR.

7. Uso de un kit según las reivindicaciones 1 a 6, para el diagnóstico de un trastorno degenerativo en un sujeto.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el trastorno degenerativo es un trastorno neurodegenerativo.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer.

10. Método para determinar o detectar la cantidad de un polipéptido diana seleccionado del grupo de A142, A140 y la mezcla de los mismos en una muestra que comprende las etapas de

(i) capturar el polipéptido diana presente en la muestra con un primer anticuerpo o combinación de anticuerpos que se unen específicamente a dicho polipéptido diana, en el que el primer anticuerpo se dirige contra un epítopo ubicado dentro de los aminoácidos 1 a 16 de A140 y A142, en el que el primer anticuerpo se ha inmovilizado previamente en un soporte sólido,

(ii) poner en contacto los complejos inmunitarios formados en la etapa (i) con un segundo anticuerpo o combinación de anticuerpos que reconocen una región del polipéptido diana que es diferente de la región que reconoce el primer anticuerpo o combinación de anticuerpos,

(iii) poner en contacto los complejos formados en la etapa (ii) con un reactivo que muestra afinidad por el segundo anticuerpo y que está acoplado a un primer miembro de un par de unión,

(iv) poner en contacto los complejos formados en la etapa (iii) con un segundo miembro de un par de unión que está acoplado a un marcador fluorescente, luminiscente o enzimático y

(v) detectar o determinar la actividad o cantidad del marcador unido al segundo miembro del par de unión, en el que el par de unión se selecciona del grupo que consiste en: hapteno y anticuerpo; antígeno y anticuerpo; biotina y avidina; biotina y estreptavidina; un análogo de biotina y avidina; un análogo de biotina y estreptavidina; azúcar y lectina; enzima y cofactor; ácido nucleico y ácido nucleico complementario y análogo de ácido nucleico y ácido nucleico complementario.

11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según la reivindicación 10, en el que el primer anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo de captura monoclonal es el Acm 6E10.

13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según la reivindicaciones 10, en el que el segundo anticuerpo es un anticuerpo seleccionado del grupo de

(i) un anticuerpo policlonal preparado contra un péptido correspondiente a la región C-terminal del péptido A142 que se une específicamente a A142 sin producir reacción cruzada sustancial con A140

(ii) un anticuerpo policlonal preparado contra un péptido correspondiente a la región C-terminal del péptido A140 que se une específicamente a A140 sin producir reacción cruzada sustancial con A142

(iii) un anticuerpo que reconoce simultáneamente la región C-terminal tanto de A140 como de A142 y (iv) una combinación de los anticuerpos según (i) y (ii) .

14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según la reivindicación 13, en el que la región C-terminal del péptido A142 usada para preparar el segundo anticuerpo es el péptido seleccionado del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o en el que la región C-terminal del péptido A140 usada para preparar el segundo anticuerpo es el péptido seleccionado del grupo de o SEQ ID NO: 3.

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que los anticuerpos primero y/o segundo se han purificado por afinidad usando un polipéptido que comprende la secuencia del polipéptido usado para su preparación.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el reactivo que muestra afinidad por el segundo anticuerpo se selecciona del grupo de un anticuerpo anti-IgG, proteína A o proteína G o una variante funcionalmente equivalente de los mismos.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicho primer miembro de un par de unión es biotina.

18. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según la reivindicación 17, en el que el

segundo miembro de un par de unión es avidina, estreptavidina o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo de sangre, suero, plasma y LCR.

20. Método para el diagnóstico de un trastorno degenerativo en un sujeto que comprende determinar la cantidad de A140 o A142 en una muestra de un paciente usando un método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 y correlacionar la concentración de uno o ambos péptidos en la muestra de dicho sujeto con respecto a la concentración de dicho péptido o péptidos en una muestra de un individuo sano con la aparición del trastorno degenerativo.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el trastorno degenerativo es un trastorno neurodegenerativo.

22. Método según la reivindicación 21, en el que el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer y en el que si la cantidad de péptidos A140 y/o A142 en dicha muestras es inferior a las cantidades de dicho péptido o péptidos en una muestra biológica del mismo origen obtenida de un individuo sano, es indicativo de que el sujeto padece enfermedad de Alzheimer.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que la muestra en la que va a detectarse A140 y/o A142 es una muestra de plasma o suero.