Ingeniería genética tisular usando poblaciones puras de células fetales no embrioblásticas aisladas.

Un método para la producción in vitro de un remplazo tisular de mamífero que comprende las etapas de:

(a) preparar una o más poblaciones sustancialmente puras de células fetales CD133-negativas noembrioblásticas aisladas de uno o más tipos in vitro por clasificación celular usando un anticuerpo oanticuerpos dirigidos contra el antígeno de superficie CD133 específico de tipo celular, en el que el tipo o tiposcelulares tienen la capacidad de formar el tejido nativo correspondiente al remplazo; y

(b) cultivar las células fetales obtenidas en la etapa (a) en condiciones que permiten el desarrollo delremplazo tisular,

en el que las células fetales son fibroblastos y sus progenitores,y en el que la etapa (b) comprende las etapas de:

(1) sembrar las células fetales que tienen capacidad de formar matriz extracelular que son fibroblastos océlulas progenitoras de los mismos sobre una estructura tridimensional;

(2) cultivar la estructura en condiciones que permiten el desarrollo del remplazo tisular hasta que se hayaformado una estructura de tejido conectivo;

(3) sembrar las células fetales que tienen características antitrombogénicas sobre la estructura que contienela estructura de tejido conectivo; y

(4) cultivar adicionalmente la estructura hasta que se haya formado al menos una monocapa de las célulasfetales que tienen características antitrombogénicas sobre la estructura de tejido conectivo.

Ingeniería genética tisular usando poblaciones puras de células fetales no embrioblásticas aisladas

La presente invención se refiere a métodos para la producción in vitro de remplazos tisulares de mamífero usando poblaciones sustancialmente puras de células fetales no embrioblásticas aisladas que tienen la capacidad de diferenciarse en el tipo o tipos celulares que forman el tejido nativo. Los remplazos tisulares diseñados por ingeniería genética mediante los métodos de la presente invención son especialmente útiles para reparar estructuras cardiovasculares no funcionales o disfuncionales en pacientes que padecen trastornos cardiovasculares congénitos.

El progreso en el tratamiento y regeneración de malformaciones y defectos congénitos ha sido significativo en las pasadas décadas, proporcionando un tratamiento quirúrgico que ha salvado la vida a numerosos pacientes cada año. Hoy en día, por ejemplo, los remplazos cardiovasculares mediante próstesis mecánicas o biológicas siguen siendo el tratamiento más habitual para la cardiopatía valvular avanzada con un uso creciente de prótesis biológicas. Sin embargo, esta terapia aún está asociada con varios problemas que provocan una significativa morbilidad y mortalidad. Siendo inherentemente diferentes del tejido que remplazan, los remplazos de válvula tanto mecánicos fabricados como biológicos a menudo están asociados con defectos tales como fallo del material, tasa aumentada de infecciones, tromboembolia y reacciones inmunológicas contra el material foráneo. Además, con la excepción del Principio de Ross, todos los procedimientos de remplazo cardiovascular contemporáneos implican estructuras no vivas que carecen de la capacidad de auto-reparación, remodelado o crecimiento.

Particularmente en la cirugía cardiaca congénita actual, existe una necesidad sustancial de materiales de remplazo apropiados con crecimiento para la reparación de defectos cardiacos congénitos. Este tratamiento quirúrgico está habitualmente basado en válvulas o conductos no autólogos con desventajas que incluyen increscencias tisulares obstructivas y calcificación del remplazo. Estas limitaciones y la ausencia de crecimiento, típicamente requieren diversas reoperaciones de los pacientes pediátricos con defectos cardiovasculares asociados con un aumento en la morbilidad y la mortalidad cada vez.

Los remplazos tisulares ideales serían una copia de sus equivalentes nativos. Particularmente en ingeniería genética de tejidos cardiovasculares, dichos remplazos deben mostrar una función mecánica adecuada, durabilidad, un rendimiento hemodinámico adecuado, así como la ausencia de reacciones inmunogénicas, trombogénicas y/o inflamatorias.

La ingeniería genética tisular aspira a cumplir estos requisitos mediante la fabricación in vitro de remplazos tisulares autólogos vivos. Por lo tanto, se obtienen y se aíslan células autólogas del tejido del paciente. Después del aislamiento, las células se expanden usando tecnología de cultivo in vitro y se siembran en matrices tridimensionales biodegradables, que pueden ser de origen biológico o sintético. Para el procedimiento de siembra, es necesaria una cantidad inicial suficiente de células para posibilitar la maduración apropiada del neo-tejido. El éxito de este procedimiento de ingeniería tisular depende de tres elementos principales: (1) la matriz biodegradable (estructura) que determina la forma tridimensional y sirve como estructura de guía inicial para la adhesión celular y el desarrollo tisular; (2) la fuente de células a partir de la cual se cultiva un tejido vivo; y (3) las condiciones de cultivo in vitro de la construcción viva antes de su implante.

Particularmente en ingeniería genética tisular cardiovascular, estos tres elementos tienen que elegirse y controlarse de un modo altamente organizado para cumplir los elevados requisitos mecánicos del neo-tejido en el momento del implante. Por ejemplo, para crear una válvula cardiaca funcional con las propiedades mecánicas del equivalente nativo, es crucial un rápido desarrollo de la matriz extracelular. Por lo tanto, la elección de las células que son responsables de la producción de una matriz extracelular es un factor importante. Actualmente se usan dos tipos celulares para la fabricación de tejidos cardiovasculares: células con la capacidad de formar matriz extracelular, habitualmente miofibroblastos, y células endoteliales con características antitrombogénicas. El procedimiento de siempre en estructuras tridimensionales se realiza principalmente de forma secuencial: primero por siembra de los miofibroblastos, seguido de las células endoteliales (Zund et al. (1998) Eur. J. Cardiothorac. Surg. 13, 160-164) . Las estructuras sembradas pueden cultivarse en sistemas estáticos o dinámicos, que tienen por objetivo un óptimo desarrollo tisular in vitro. Se ha demostrado que el precondicionamiento mecánico acelera la producción de tejidos funcionales viables, haciendo que sean apropiados para su implante (Niklason et al. (1999) Science 284, 489-493; Hoerstrup et al. (2000) Tissue Eng. 6, 75-79) .

En contraste con las estructuras altamente estandarizadas y fabricadas industrialmente, la calidad de las células varía de un paciente a otro, dependiendo de las características tisulares individuales y las co-morbilidades. Para crear un remplazo tisular vivo y funcional, la elección de la fuente celular es crítica. Más allá de la capacidad de crecimiento y expansión celular, una cuestión importante es la posibilidad de desarrollar un fenotipo celular que coincida con los equivalentes nativos. Se espera que esto tenga un impacto importante sobre la funcionalidad a largo plazo de los remplazos (Butcher et al. (2004) J. Heart Valve Disease 13, 478-486) . El uso de células originarias del tejido a remplazar sería el enfoque más seguro. En el caso del diseño de tejido de válvulas cardiacas, se ha demostrado que es factible el uso de células intersticiales valvulares obtenidas por biopsia (Maish et al. (2003) J. Heart Valve Disease 12, 264-269) . Sin embargo, con respecto a aplicaciones clínicas, es difícil obtener estas células y el procedimiento alberga riesgos sustanciales.

Particularmente para la fabricación de remplazos tisulares diseñados para aplicaciones pediátricas, aún no se ha identificado la fuente celular ideal. La fuente celular ideal debería ser fácilmente accesible y debe permitir la recolección de células prenatales para tener la construcción tisular diseñada lista en o poco después del nacimiento para evitar daños secundarios en el corazón del bebé.

Estudios previos describían células prenatales de oveja de fluido amniótico como una nueva fuente de células para el diseño de tejidos para la reconstrucción del diafragma en un modelo animal (Kaviani et al. (2003) J. Am. Coll. Surg. 196, 592-597; Fuchs et al. (2004) J. Ped. Surg. 39, 834-838) . Kaviani et al. (J. Ped. Surg. 37, 995-999, 2002) informó del uso células derivadas de fluido amniótico obtenidas a las 16 a 21 semanas en comparación con células de placenta humana postnatales obtenidas de placenta proporcionada por cesárea a las 33 a 35 semanas de gestación. Sin embargo, hasta la fecha no pudo demostrarse ni la formación de tejido incluyendo elementos conectivos de matriz extracelular ni la funcionalidad de las construcciones con geometría compleja que han crecido a partir de estas células.

Por consiguiente, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar métodos mejorados para la producción de remplazos tisulares de mamífero.

La solución del problema técnico anterior se proporciona por las realizaciones de la presente invención definida en las reivindicaciones.

En particular, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción in vitro de un remplazo tisular de mamífero que comprende las etapas de:

(a) preparar una o más poblaciones sustancialmente puras de células fetales no embrioblásticas aisladas de uno o más tipo in vitro, donde el tipo o tipos celulares tienen la capacidad de formar el tejido nativo correspondiente al remplazo; y

(b) cultivar las células fetales obtenidas en la etapa (a) en condiciones que permitan el desarrollo del remplazo tisular.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que la separación y aislamiento de esos tipos celulares fetales no embrioblásticos que tienen capacidad de formar el remplazo tisular deseado es esencial para... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción in vitro de un remplazo tisular de mamífero que comprende las etapas de:

(a) preparar una o más poblaciones sustancialmente puras de células fetales CD133-negativas no embrioblásticas aisladas de uno o más tipos in vitro por clasificación celular usando un anticuerpo o anticuerpos dirigidos contra el antígeno de superficie CD133 específico de tipo celular, en el que el tipo o tipos celulares tienen la capacidad de formar el tejido nativo correspondiente al remplazo; y

(b) cultivar las células fetales obtenidas en la etapa (a) en condiciones que permiten el desarrollo del remplazo tisular,

en el que las células fetales son fibroblastos y sus progenitores, y en el que la etapa (b) comprende las etapas de:

(1) sembrar las células fetales que tienen capacidad de formar matriz extracelular que son fibroblastos o células progenitoras de los mismos sobre una estructura tridimensional;

(2) cultivar la estructura en condiciones que permiten el desarrollo del remplazo tisular hasta que se haya formado una estructura de tejido conectivo;

(3) sembrar las células fetales que tienen características antitrombogénicas sobre la estructura que contiene la estructura de tejido conectivo; y

(4) cultivar adicionalmente la estructura hasta que se haya formado al menos una monocapa de las células fetales que tienen características antitrombogénicas sobre la estructura de tejido conectivo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las células fetales incluyen células miofibroblásticas.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las células fetales se aíslan de sangre materna, tejido materno, fluido amniótico, y/o vellosidades coriónicas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que las células fetales se aíslan de vellosidades coriónicas en la fase de la 5ª a la 23ª, preferiblemente de la 11ª a la 15ª, semana de embarazo.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (a) se realiza por citometría de flujo, preferiblemente clasificación de células activadas por fluorescencia y/o clasificación de células magnéticas.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células fetales obtenidas de la etapa (a) se almacenan congeladas antes de realizar la etapa (b) .

7. El método de la reivindicación 6, en el que las células fetales se expanden antes de almacenarse congeladas.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el remplazo tisular es una estructura cardiovascular.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la estructura cardiovascular es una válvula cardiaca, un vaso sanguíneo o parte del mismo.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el remplazo es un remplazo tisular humano.