IDENTIFICACIÓN DE UNA BETA-1,3-N-ACETILGALACTOSAMINILTRANFERASA (CGTE) DE CAMPYLOBACTER JEJUNI LIO87.

Identificación de una beta-1,3-N-acetilgalactosaminiltranferasa (CGTE) de Campylobacter jejuni LIO87. Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.º 60/670.608, presentada el 11 de abril de 2005. Antecedentes de la invención Los hidratos de carbono se reconocen ahora como de gran importancia en muchos acontecimientos de reconocimiento célula-célula, particularmente la adhesión de bacterias y virus a células de mamífero en la patogénesis y la interacción leucocito-célula endotelial a través de selectinas en la inflamación (Varki (1993) Glycobiology 3: 97-130). Además, se cree que los glicoconjugados sialilados que se encuentran en bacterias (Preston et al. (1996) Crit. Rev. Microbiol. 22:139-180; Reuter et al. (1996) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 377:325-342) imitan a los oligosacáridos que se encuentran en los glicolípidos de mamíferos para evadir la respuesta inmunitaria del huésped (Moran et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16:105-115). La imitación molecular de estructuras del huésped por la parte de sacárido del lipopolisacárido (LPS) se considera que es un factor de virulencia de diversos patógenos de la mucosa, que usan esta estrategia para evadir la respuesta inmunitaria del huésped (Moran et al. (1996) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16: 105-115; Moran et al. (1996) J. Endotoxin Res. 3: 521-531). Las estructuras de oligosacáridos que participan en estos y otros procesos son posibles agentes terapéuticos, pero requieren mucho tiempo y son caros de preparar por medios químicos tradicionales. Una vía muy prometedora para la producción de estructuras de oligosacáridos específicas es a través del uso de las enzimas que las producen in vivo, las glicosiltransferasas. Tales enzimas pueden usarse como catalizadores regio y estereoselectivos para la síntesis in vitro de oligosacáridos (Ichikawa et al. (1992) Anal. Biochem. 202: 215-238). La síntesis enzimática a gran escala de oligosacáridos depende de la disponibilidad de suficientes cantidades de las glicosiltransferasas requeridas. Sin embargo, la producción de glicosiltransferasas en cantidades suficientes para su uso en la preparación de estructuras de oligosacáridos ha sido problemática. Se ha logrado la expresión de muchas glicosiltransferasas de mamífero con la participación de expresión en huéspedes eucariotas, lo que puede implicar medios de cultivo tisular caros y rendimientos de proteína sólo moderados (Kleene et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 160-167; Williams et al. (1995) Glycoconjugate J. 12: 755-761). Se ha logrado la expresión en E. coli para glicosiltransferasas de mamífero, pero estos intentos han producido principalmente formas insolubles de la enzima a partir de las cuales ha sido difícil recuperar enzima activa en grandes cantidades (Aoki et al. (1990) EMBO. J. 9:3171- 3178; Nishiu et al. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59 (9): 1750-1752). Además, debido a la actividad biológica de sus productos, las sialiltransferasas de mamífero actúan generalmente en tejidos específicos, compartimentos celulares y/o etapas del desarrollo para crear estructuras de glicano precisas. La identificación de glicosiltransferasas que pueden usarse en la síntesis enzimática de oligosacáridos comercialmente valiosos y que pueden producirse en grandes cantidades sería por tanto útil en el desarrollo de estas tecnologías. La presente invención satisface ésta y otras necesidades. La base de datos (UNIPROT [en línea] versión de lanzamiento 01-02-2005 1 de octubre de 2002 (01-10-2002), XP002510530 recuperado del número de registro de EBI UNIPROT: Q8KWRO da a conocer la secuencia de una galactosiltransferasa supuesta. La base de datos EMBL [en línea] 12 de enero de 2005, XP002510532 recuperado del número de registro de EBI: EMBL:CP000025 da a conocer el genoma completo de Campylobacter jejuni RMI221. El documento US2004/259140 describe glicosiltransferasas procariotas, incluyendo una sialiltransferasa bifuncional que tiene actividad tanto 2,3 como 2,8. Se describen también una 1,4-GalNAc transferasa y una 1,3galactosiltransferasa, así como otras glicosiltransferasas y enzimas implicadas en la síntesis de lipooligosacárido (LOS). Breve sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado para una reacción de N-acetilgalactosaminilación, en el que el polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO: 2. El polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa transfiere un resto de galactosa de un sustrato donador a un sustrato aceptor. Un resto de galactosa puede ser, por ejemplo, o bien galactosa o bien GalNAc. En una realización preferida, el resto de galactosa es GalNAc. En otra realización, el polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En otro aspecto, la presente invención proporciona una mezcla de reacción para producir el producto de sacárido Nacetilgalactosaminilado en el que un resto de N-acetilgalactosaminilo está unido a un resto de oligosacárido mediante un enlace -1,3, comprendiendo la mezcla de reacción: un polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado; un sustrato donador que comprende un resto de N- acetilgalactosaminilo; y un sustrato aceptor que comprende un resto de oligosacárido, en el que el polipéptido de - 2 E06721794 26-12-2011   1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un producto de sacárido Nacetilgalactosaminilado, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto un sustrato aceptor con un sustrato donador que comprende un resto de GalNAc y un polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado con una identidad de al menos el 90% o el 95% con SEQ ID NO:2; y b) permitir que se produzca la transferencia del resto de GalNAc al sacárido aceptor, produciendo de ese modo el producto de sacárido N-acetilgalactosaminilado. En una realización, el polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En una realización preferida, el método de galactosilación se realiza a una escala de producción comercial. En una realización preferida adicional, el sustrato aceptor es un glicopéptido o una glicoproteína. Breve descripción de los dibujos La figura 1 proporciona la estructura de GalNAc-1,3-Gal-1,4-Gal-1,4-GlcNAc-p-nitrofenilo sintetizado a partir de Gal-1,4-Gal-1,4-GlcNAc-p-nitrofenilo usando CgtE. La figura 2 proporciona el espectro de 1 H- 13 C HSQC del compuesto de p-nitrofenilo de tetrasacárido. Los picos cruzados se marcan tal como sigue: a para GlcNAc, b para Gal(1-4), c para Gal(1-4) y d para GalNAc(1-3). Las resonancias del carbono en las posiciones a4, b4 y c3 presentan desplazamiento a campo bajo en comparación con valores de monosacárido, lo que concuerda con su participación en un enlace glicosídico. La figura 3 proporciona una alineación entre los residuos 5-167 de la proteína CgtE (línea superior) y los residuos 1- 161 de la secuencia consenso glycosyl_trans_f2 (línea inferior). Los residuos idénticos están en negrita y los residuos conservados están subrayados. Descripción detallada de la invención I. Introducción El locus de biosíntesis de lipooligosacárido (LOS) se ha secuenciado en diversas cepas de Campylobacter jejuni como parte de un proyecto sobre la genómica comparativa de este locus. Véanse, por ejemplo, Gilbert, et al, J. Biol Chem. 275:3896-3906 (2000); Gilbert, et al., J. Biol. Chem. 277:327-337 (2002); y Gilbert, et al., en Campylobacter: Molecular and Cellular Biology. (Horizon Bioscience, Editors: J.M. Ketley y M. E. Konkel), capítulo 11 (2005). C. jejuni LIO87 es una cepa tipo del sistema de serotipado LIOR (termolábil). La organización del locus LOS de L1087 (clase D, número de registro de GenBank AF400669) es distinto de la mayoría de los locus LOS de C. jejuni caracterizados hasta la fecha (clases A, B y C, Gilbert et al. 2002). El locus LOS de C jejuni LIO87 carece de la agrupación de genes implicados en la biosíntesis de ácido siálico y en la expresión de núcleos externos de LOS que imitan gangliósidos. El locus LOS de C. jejuni LIO87 incluye 10 marcos de lectura abiertos (ORF). Búsquedas de homología de secuencia indicaron que cuatro de estos ORF (los ORF n.º 1, n.º 2, n.º 3 y n.º 10) están implicados en la biosíntesis del núcleo interno o el lípido. No fue posible deducir las especificidades donadoras o aceptoras de las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado para una reacción de N-acetilgalactosaminilación, en el que un resto de N-acetilgalactosaminilo está unido a un resto de oligosacárido mediante un enlace -1,3, en el que el polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO: 2. 2. Mezcla de reacción para producir un producto de sacárido N-acetilgalactosaminilado en el que un resto de N-acetilgalactosaminilo está unido a un resto de oligosacárido mediante un enlace -1,3, comprendiendo la mezcla de reacción: un polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado; un sustrato donador que comprende un resto de N-acetilgalactosaminilo; y un sustrato aceptor que comprende un resto de oligosacárido, en el que el polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO: 2. 3. Método de producción de un producto de sacárido N-acetilgalactosaminilado, comprendiendo el método la etapa de: a) poner en contacto un sustrato aceptor que comprende un resto de oligosacárido con un sustrato donador que comprende un resto de N-acetilgalactosaminilo y un polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa recombinante o aislado con una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO:2; y b) permitir que se produzca la transferencia del resto de N-acetilgalactosaminilo al sacárido aceptor, en el que un resto de N-acetilgalactosaminilo está unido a un resto de oligosacárido mediante un enlace -1,3 produciendo de ese modo el producto de sacárido N-acetilgalactosaminilado. 4. Uso según la reivindicación 1, mezcla de reacción según la reivindicación 2, o método según la reivindicación 3, en los que el polipéptido de -1,3-N-acetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 95% con SEQ ID NO:2. 5. Uso según la reivindicación 1, método según la reivindicación 3, en los que el polipéptido de -1,3-Nacetilgalactosaminiltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 6. Método según la reivindicación 5, realizándose el método a una escala de producción de gramo en una única reacción. E06721794 26-12-2011   26 E06721794 26-12-2011   27 E06721794 26-12-2011   28 E06721794 26-12-2011