Un marcador genético aislado y purificado asociado con contenido de aceite oleico alto en Brassica,

localizándosedicho marcador en un grupo de ligamiento seleccionado del grupo que consiste en N5 y N1 en el genoma deBrassica, teniendo dicho marcador una secuencia de SEQ. ID. NO. 5.

Genes FAD2 y FAD3 Alterados en Brassica y la detección asistida por marcadores moleculares de éstos.

Campo de la Invención

La presente invención se refiere en general a métodos y materiales para uso en la mejora genética de plantas. Más 5 específicamente, la presente invención se refiere a la identificación asistida por marcadores de genes que codifican rasgos fenotípicos en especies de plantas de semillas oleaginosas y en especies de Brassica en particular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El género Brassica incluye canola, uno de los cultivos de semillas oleaginosas más importantes del mundo, y el cultivo de semillas oleaginosas más importante que se crece en regiones geográficas templadas. La canola se ha

caracterizado tradicionalmente como Brassica napus (una especie derivada como resultado de cruces interespecíficos de Brassica rapa y Brassica oleracea) en la que el ácido erúcico y los glicosinolatos se han eliminado o reducido significativamente mediante mejora genética convencional. La mayor parte del aceite de canola está en la forma de aceites vegetales producidos para consumo humano. También existe un mercado creciente para el uso de aceite de canola en aplicaciones industriales.

La canola es una especie poliploide que se considera que ha surgido a partir de la hibridación de Brassica oleracea, que tiene un genoma diploide C, y Brassica rapa, que tiene un genoma diploide A. Las investigaciones citogenéticas revelaron que los genomas AA y CC muestran un grado de relación, siendo parcialmente homólogos entre sí y se piensa que han derivado de un genoma ancestral común (Prakash y Hinata, 1980) . Aunque se clasifican técnicamente como diploides, los genomas de ambas especies progenitoras contienen un alto porcentaje de

regiones duplicativas uno del otro (Song et al., 1991) . El análisis genético reveló que el genoma AA de Brassica rapa contribuía con diez cromosomas a Brassica napus, mientras que Brassica oleracea contribuía con nueve cromosomas de su genoma CC como el donante materno (Song et al., 1992) .

La calidad del aceite comestible e industrial derivado de una variedad particular de semilla de canola se determina por sus ácidos grasos constituyentes, ya que el tipo y cantidad de insaturación de los ácidos grasos tiene 25 implicaciones para las aplicaciones tanto dietéticas como industriales. El aceite de canola convencional contiene aproximadamente 60% de ácido oleico (C18:1) , 20% de ácido linoleico (C18:2) y 10% de ácido linolénico (18:3) . Los niveles de ácido linolénico poliinsaturado típicos de canola convencional son indeseables ya que el aceite se oxida fácilmente, viéndose afectada la proporción de oxidación por varios factores, incluyendo la presencia de oxígeno, exposición a la luz y calor, y la presencia de antioxidantes y pro-oxidantes nativos o añadidos en el aceite. La

oxidación causa sabores anormales y rancidez como resultado de fritura repetida (oxidación inducida) o almacenamiento durante un periodo prolongado (auto-oxidación) . La oxidación también puede alterar las propiedades lubricantes y viscosas del aceite de canola.

Los aceites que presentan niveles reducidos de ácidos grasos poliinsaturados e incrementos en el nivel de ácido oleico monoinsaturado respecto al aceite de canola convencional están asociados con una mayor estabilidad 35 oxidativa. La susceptibilidad de los ácidos grasos individuales a la oxidación depende de su grado de insaturación. Así, la velocidad de oxidación del ácido linolénico, que posee tres enlaces dobles carbono-carbono, es 25 veces la del ácido oleico, que sólo tiene un doble enlace, y 2 veces la del ácido linoleico, que tiene dos dobles enlaces. Los ácidos linoleico y linolénico son los que tienen el mayor impacto en el sabor y olor porque forman fácilmente hidroperóxidos. El aceite oleico alto (º70% oleico) es menos susceptible a la oxidación durante el almacenamiento,

fritura y refinamiento, y puede ser calentado a una temperatura más alta sin producir humo, haciéndolo más adecuado como aceite de cocina.

Generalmente se usan dos estrategias para incrementar la estabilidad oxidativa del aceite de canola. En una estrategia, se usa la hidrogenación parcial para disminuir el contenido de ácido linolénico. Desafortunadamente, la hidrogenación parcial da lugar a la formación de ácidos grasos trans, que se han asociado a niveles elevados de 45 colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL o colesterol "malo") en la sangre y, consecuentemente, a un riesgo incrementado de enfermedad cardiaca coronaria. La segunda estrategia principal implica programas de mejora genética para desarrollar variedades de canola con niveles altos de ácido oleico y bajos de linolénico respecto al aceite de canola convencional. Se han producido mutantes con oleico alto y linolénico bajo mediante mutagénesis (Rakow, 1973; Wong et al. 1991; Auld et al. 1992) y modificación transgénica (Debonte e Hitz, 1996) . Los ejemplos 50 de variedades de canola vendidas comercialmente que tienen un perfil de ácidos grasos de C18:1 por encima del 70% y C18:3 por debajo del 3, 5% son las variedades Nexera™, comercializadas por Dow AgroSciences LLC (Indianapolis, IN) , variedades que producen aceite Natreon™. Una de dichas líneas, AG019 (una variedad de Nexera™) contiene 71-78% ácido oleico (C18:1) y <3% linolénico (C18:3) . AG019 se creó originariamente por mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS) y se describe en US 6.169.190 B1 de Sernyk, cedida al cesionario

55 de la presente invención.

Los métodos actuales para producir semillas de Brassica híbridas F1 tienen limitaciones definidas en términos de coste y pureza de las semillas. Generalmente, estos métodos requieren líneas parentales mejoradas estables,

incompatibles con hermanos y auto-incompatibles, casi homocigotas, líneas parentales mejoradas que están disponibles sólo después de autopolinización repetida para generar líneas endogámicas. Además, la endogamia para desarrollar y mantener las líneas parentales se consigue por técnicas de trabajo intensivas, tales como autopolinización en preantesis, ya que los sistemas de producción de semillas híbridas de Brassica basados en rasgos auto-incompatibles deben utilizar plantas fuertemente auto-incompatibles. Las condiciones medioambientales durante el proceso de mejora genética, tales como temperatura y humedad, afectan típicamente el metabolismo lipídico de la planta, afectando así también al nivel de contenido de ácidos grasos (Harwood, 1999) . La variabilidad medioambiental hace, por lo tanto, que la selección fenotípica de las plantas sea menos fiable. Deng y Scarth (1998) encontraron que el incremento en la temperatura post-floración reducía significativamente los niveles de C18:3 e incrementaba los de C18:1. Se indicaron resultados similares en otros estudios (Yermanos y Goodin, 1965; Canvin, 1965) .

La mejora genética para variedades con linolénico bajo es particularmente desafiante ya que el contenido de C18:3 es un rasgo multi-génico y se hereda de manera recesiva con una heredabilidad relativamente baja. Los análisis genéticos de una población derivada del cruce entre "Stellar" (que tiene un contenido bajo de C18:3 (3%) ) y "Drakkar" (que tiene un nivel "convencional" de C18:3 (9-10%) ) indicaron que el rasgo de C18:3 bajo estaba controlado por dos loci principales con efectos aditivos designados L1 y L2 (Jourdren et al., 1996b) . Se encontró que estos dos loci principales que controlan el contenido de C18:3 correspondían a dos genes fad3 (ácido graso desaturada 3) ; uno localizado en el genoma A (que se origina de Brassica rapa) y el otro en el genoma C (que se origina de (Brassica olecera) (Jourdren et al., 1996; Barret et al., 1999) .

Los rasgos que están variando continuamente debido a influencias genéticas (aditivas, dominantes y epistáticas) y medioambientales se refieren comúnmente como "rasgos cuantitativos". Los rasgos cuantitativos pueden distinguirse de los rasgos "cualitativos" o "discretos" tomando como base dos factores: influencias medioambientales en la expresión génica que producen una distribución continua de los fenotipos; y el patrón de segregación complejo producido por herencia multigénica. La identificación de una o más regiones del genoma ligadas a la expresión de un rasgo cuantitativo dio lugar al descubrimiento de Loci de Rasgos Cuantitativos ("QTL") . Thormann et al. (1996) localizaron dos QTL que explicaban... [Seguir leyendo]

1. Un marcador genético aislado y purificado asociado con contenido de aceite oleico alto en Brassica, localizándose dicho marcador en un grupo de ligamiento seleccionado del grupo que consiste en N5 y N1 en el genoma de Brassica, teniendo dicho marcador una secuencia de SEQ. ID. NO. 5.

2. Un marcador genético aislado y purificado asociado con contenido de aceite linolénico bajo en Brassica, localizándose dicho marcador en un grupo de ligamiento seleccionado del grupo que consiste en N14 y N4 en el genoma de Brassica, teniendo dicho marcador una secuencia de SEQ. ID. NO. 6.

3. El marcador genético aislado y purificado de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que Brassica es canola.

4. Un método para identificar ácido nucleico como un modulador de contenido de ácido oleico alto y/o de ácido linolénico bajo en Brassica, comprendiendo el método:

exponer ácido nucleico de Brassica a un marcador molecular seleccionado del grupo que consiste en SEQ. ID. No. 5 y/o 6, en el que el marcador mostrado como SEQ ID NO: 5 está asociado con contenido de aceite oleico alto y en el que el marcador mostrado como SEQ ID NO: 6 está asociado con contenido de aceite linolénico bajo.

5. Un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. No. 7 o una variante degenerada de SEQ. ID. No. 7.

6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No. 8.

7. Un ácido nucleico aislado de una especie de Brassica que comprende un gen fad32 que tienen una mutación en la secuencia de +1G a +1A en el sitio de corte y empalme 5' correspondiente a la posición 530 del gen fad32 de DMS100 de SEQ ID NO: 12.

8. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 7 en el que la especie de Brassica es canola.

9. Un ácido nucleico aislado de una especie de Brassica que comprende un gen fad2 que tiene una mutación en una posición correspondiente a la posición 411 del gen fad2 de DMS100 de SEQ ID NO: 7, en el que la mutación crea un codón de parada.

10. Uso del marcador genético de las reivindicaciones 1 ó 2 para la selección de plantas con semillas oleaginosas con oleico alto y/o linolénico bajo en el que el marcador mostrado como SEQ ID NO: 5 está asociado con contenido de aceite oleico alto y en el que el marcador mostrado como SEQ ID NO: 6 está asociado con contenido de aceite linolénico bajo.

Figura 1. Secuencias de nucleótidos genómicas del gen fad2 clonado a partir de DMS100 y Quantum. La parte superior es la secuencia de DMS100 y la parte inferior es la secuencia de Quantum. La punta de flecha indica una mutación de un único nucleótido de C a T, que resultó en un codón de parada (TAG) sombreado en amarillo. Los cebadores directos e inversos para el marcador específico de alelo mutante basado en PCR están en negrita y subrayados.

Figura 2. Secuencias de aminoácidos del gen fad2, clonado a partir de DMS100, Quantum y del gen fad2 publicado de Brassica napus (BNfad2) . La punta de flecha indica la posición del codón de parada que resulta de una mutación en un único nucleótido (C a T) en DMS100.

Fig. 4

Tabla 1. La correlación de los marcadores específicos de alelo mutante y el contenido de ácidos grasos de 184 líneas DH derivadas del cruce de Quantum y DMS100

** significativo a t = 0, 01.

Figura 4. Productos de PCR amplificados a partir del marcador específico de alelo mutante para el gen fad2. M, escalera de ADN de 100 pb; Carril 1, DMS100; carril 2, Quantum; carriles 3-27, líneas DH del cruce de Quantum y DMS100. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1, 5% y se tiñeron con bromuro de etidio.