Un polipéptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales en un mamífero,

en donde dicho polipéptido está constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que está contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoácidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D.

Factor recombinante de crecimiento de las celulas endoteliales vasculares-D (VEGF-D)

Esta invencion se refiere a polipeptidos VEGF-D maduros, a DNA que codifica dichos polipeptidos y a composiciones farmaceuticas y diagnosticas y metodos que utilizan o se derivan de los polipeptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La angiogenesis es un proceso fundamental requerido para el crecimiento y desarrollo normales de los tejidos, e implica la proliferacion de capilares nuevos a partir de vasos sanguineos preexistentes. La angiogenesis no solo esta implicada en el desarrollo embrionario y el crecimiento, reparacion y regeneracion normales de los tejidos, sino que esta implicada tambien en el ciclo reproductor femenino, el establecimiento y mantenimiento del embarazo, y en la reparacion de heridas y fracturas. Ademas de la angiogenesis que tiene lugar en el individuo normal, estan implicados sucesos angiogenicos en cierto numero de procesos patologicos, particularmente el crecimiento y la metastasis de los tumores, y otras condiciones en las cuales la proliferacion de vasos sanguineos, especialmente del sistema microvascular, esta incrementada, tales como retinopatia diabetica, psoriasis y artropatias. La inhibicion de la angiogenesis es util en la prevencion o el alivio de estos procesos patologicos.

Por otra parte, la promocion de la angiogenesis es deseable en situaciones en las cuales la vascularizacion debe establecerse o extenderse, por ejemplo despues de trasplante de tejidos u organos, o para estimular el establecimiento de la circulacion colateral en el infarto tisular o la estenosis arterial, tal como en la enfermedad cardiaca coronaria y la tromboangitis obliterante.

Debido al papel crucial de la angiogenesis en tantos procesos patologicos, los factores implicados en el control de la angiogenesis han sido investigados intensamente. Se ha demostrado que cierto numero de factores de crecimiento estan involucrados en la regulacion de la angiogenesis; estos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) , factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) , factor a del crecimiento transformante (TGFa) , y factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) . Vease por ejemplo, Folkman et at, "Angiogenesis", J. Biol. Chem., 1992, 267, 10931-10934 para una revision.

Se ha sugerido que una familia particular de factores de crecimiento endotelial especificos de celulas y sus receptores correspondientes es fundamentalmente responsable de la estimulacion del crecimiento y la diferenciacion de las celulas endoteliales, y de ciertas funciones de las celulas diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia PDGF, y parecen actuar por la via de tirosina-quinasas receptoras endoteliales (RTKs) . Hasta ahora, se han identificado cuatro subtipos de factor de crecimiento endotelial vascular. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , conocido actualmente como VEGF-A, ha sido aislado de varias fuentes. VEGF-A exhibe actividad mitogena altamente especifica contra las celulas endoteliales y puede estimular la secuencia total de sucesos que conducen a la angiogenesis. Adicionalmente, el mismo presenta actividad quimioatractiva frente a los monocitos, puede inducir el activador del plasminogeno y el inhibidor del activador del plasminogeno en las celulas endoteliales, y puede influir tambien en la permeabilidad vascular. Debido a la ultima actividad, se hace referencia a veces al mismo como factor de permeabilidad vascular (VTF) . El aislamiento y las propiedades de VEGF han sido revisados; vease Ferrara et at, Ferrara et at, "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 1991 47 211218 y Connolly, "Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223.

En fecha mas reciente, se han identificado tres miembros adicionales de la familia VEGF. Estos se designan VEGF-B, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/02957 (W0 96/26736) por Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki, VEGF-C, descrito en Joukov et at, The EMBO Journal, 1996 15 290298, y VEGF2, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US94/05291 (WO 95/24473) por Human Genome Sciences, Inc. VEGF-B tiene propiedades angiogenicas y de otros tipos estrechamente similares a las de VEGF, pero esta distribuido y expresado en los tejidos de modo distinto que VEGF. En particular, VEGF-B se expresa muy intensamente en el corazon, y solo debilmente en el pulmon, en tanto que sucede lo contrario en el caso de VEGF. Esto sugiere que VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

VEGF-B se aislo utilizando una tecnica de cribado con trampa de interaccion co-hibrida de levadura, cribado para proteinas celulares que podrian interaccionar con la proteina tipo I de fijacion de acido retinoico celular (CRABP-I) . Su aislamiento y sus caracteristicas se describen en detalle en PCT/US 96/02597 y en Olofsson et at, Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 2576-2581.

VEGF-C se aislo de medios acondicionados de la linea de celulas de adenocarcinoma de prostata PC-3 (CRL1435) por cribado respecto a la capacidad del medio para producir la fosforilacion de la tirosina de la tirosinaquinasa del receptor especifico de las celulas endoteliales Flt, utilizando celulas transfectadas para expresar Flt4. VEGF-C se purifico utilizando cromatografia de afinidad con Flt4 recombinante, y se clono a partir de una biblioteca de cDNA de PC-3. Su aislamiento y caracteristicas se describen en detalle en Joukov et at, The EMBO Journal, 1996, 15, 290-298.

VEGF2 se aislo de una linea de celulas de cancer de mama humano altamente tumorigena, independiente de estrogenos. Si bien se afirma que esta molecula tiene aproximadamente 22% de homologia a PDGF y 30% de homologia a VEGF, el metodo de aislamiento del gen que codifica VEGF2 no esta claro, y no se ha descrito caracterizacion alguna de la actividad biologica.

Los factores de crecimiento endotelial vascular parecen actuar por fijacion a tirosina-quinasas receptoras de la familia de los receptores de PDGF. Han sido identificadas 5 tirosina-quinasas receptoras especificas de las celulas endoteliales, a saber Flt-1 (VEGFR-1) , KDR/Flk-1 (VEGFR-2) , Flt4 (VEGFR-3) , Tie y Tek/Tie-2. Todas estas tienen la actividad intrinseca de la tirosina-quinasa que es necesaria para la transduccion de senales. El papel esencial, especifico en la vasculogenesis y angiogenesis de Flt-1, Flk-1, Tie y Tek/Tie-2 ha sido demostrado por mutaciones direccionadas que desactivan estos receptores en embriones de raton. VEGFR-1 y VEGFR-2 fijan VEGF con afinidad alta, y VEGFR-1 fija tambien VEGF-B y el factor de crecimiento de la placenta (PlGF) . Se ha demostrado que VEGF-C es el ligando para Flt4 (VEGFR-3) , y activa tambien VEGFR-2 (Joukov et at, 1996) . Un ligando para Tek/Tie-2 ha sido descrito por Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) ; sin embargo, el ligando para Tie no ha sido identificado todavia.

El receptor Flt-4 se expresa en los endotelios venoso y linfatico del feto, y predominantemente en los endotelios linfaticos del adulto (Kaipainen et at, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92, 3566-3570) . Se ha sugerido que VEGF-C puede tener una funcion primaria en el endotelio linfatico y una funcion secundaria en la regulacion de la angiogenesis y la permeabilidad que es compartida con VEGF (Joukov, et at, 1996) .

Los autores de la presente invencion han aislado ahora cDNA humano que codifica una nueva proteina de la familia de los factores de crecimiento endotelial vascular. La nueva proteina, designada VEGF-D, tiene semejanzas estructurales con otros miembros de esta familia.

SUMARIO DE LA INVENCION

La invencion proporciona en general un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero, en donde dicho polipeptido esta constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que esta contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoacidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D, secuencias de DNA aisladas que codifican el polipeptido (con la condicion de que el polipeptido codificado no sea VEGF-D de longitud total (SEQ ID NO: 5) ) , un anticuerpo especificamente reactivo con el polipeptido, y composiciones utiles para aplicaciones diagnosticas y/o terapeuticas. Se describe tambien una molecula de acido nucleico aislada y purificada que codifica un nuevo polipeptido, designado VEGF-D, que es estructuralmente homologo a VEGF, VEGF-B y VEGF-C.... [Seguir leyendo]

REIVINDICACIoNES

1. Un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero, en donde dicho polipeptido esta constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que esta contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoacidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D.

2. Un polipeptido aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta constituido por los residuos de aminoacidos desde 92 hasta 205 de SEQ ID NO: 5.

3. Un polipeptido aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta constituido por los residuos de aminoacidos desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.

4. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con la condicion de que el polipeptido codificado no sea VEGF-D de longitud total (SEQ ID NO: 5) .

5. Una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 4, que es un DNA genomico.

6. Una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 4, que es un cDNA.

7. Un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el acido nucleico es un cDNA que codifica el polipeptido de la reivindicacion 3 y esta conectado operativamente a un DNA que codifica la secuencia senal para secrecion de proteina por el gen de interleuquina-3 (IL-3) .

9. Una celula hospedadora transformada o transfectada con un vector de acuerdo con la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8.

10. Un anticuerpo especificamente reactivo con un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un metodo de construccion de un vector capaz de expresar un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho metodo insertar el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 en un vector en una posicion en la que dicha molecula de acido nucleico este conectada operativamente con al menos un promotor y/u otras secuencias de control.

12. Un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para utilizar en la estimulacion de la angiogenesis y/o la neovascularizacion en un mamifero.

13. Un polipeptido para utilizar de acuerdo con la reivindicacion 12, para su uso en la aceleracion de la angiogenesis en la curacion de las heridas, trasplante de tejidos u organos; o para el establecimiento de la circulacion colateral en infartos tisulares o estenosis arterial.

14. Un polipeptido para utilizar de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde las celulas endoteliales son celulas endoteliales de vasos linfaticos.

15. Una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 10.

FIG.2

Proteina eepresaea

Anti6cerpoºIºP

HMW ΔNΔC-melSP-VEGF-C-H6 Variante de remodelación de VEGF-C No infectada VEGF-D #1 de longitud total VEGF-D #2 de longitud total

VEGF-D #3 de longitud total ΔNΔC-melSP-VEGF-D-H6 #1 VEGF-D-H6 #1 de longitud total

VEGF-3 (sin procesar)