EXPRESIÓN DIRECTA DE PÉPTIDOS EN MEDIOS DE CULTIVO.

Un método de producir un péptido amidado que comprende: (a) cultivar células huésped de E.

coli que comprenden un vector de expresión que comprende dos casetes de transcripción, en donde cada uno de dichos casetes de transcripción comprende: (i) una región codificante con ácidos nucleicos que codifican un producto peptídico acoplado en el mismo marco de lectura en 3' de ácidos nucleicos que codifican un péptido señal; y (ii) una región control operativamente unida con la región codificante, dicha región control comprende una pluralidad de promotores y al menos un sitio de unión a ribosomas, en donde al menos uno de dichos promotores es tac, en donde dichas células huésped expresan un producto peptídico que tiene una glicina C-terminal junto con un péptido señal N-terminal en condiciones en donde el crecimiento de dichas células huésped se controla para que esté dentro de un intervalo de 0,05 a 0,20 duplicaciones por hora; en donde el cultivo se induce durante parte del periodo de dicho crecimiento controlado; (b) recuperar dicho producto peptídico del medio de cultivo; y (c) convertir dicho producto peptídico a un péptido amidado convirtiendo dicha glicina C-terminal a un grupo amino

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09006784.

Solicitante: UNIGENE LABORATORIES INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 110 LITTLE FALLS ROAD FAIRFIELD, NJ 07004-2193 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: Mehta,Nozar,M, Ray,Martha,V.,L, Meenan,Christopher,P, Consalvo,Angelo,P.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 15 de Abril de 1998.

Clasificación PCT:

  • C12N1/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo.
  • C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/63 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/06 C12P 21/00 […] › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.

PDF original: ES-2375330_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico en el medio de cultivo de células huésped genéticamente manipuladas que expresan el producto peptídico. Más en particular, la invención se refiere a vectores de expresión, células huésped y/o métodos de fermentación para la producción de un producto peptídico que se excreta fuera del huésped en el medio de cultivo con alto rendimiento. En algunas formas de realización, la invención se refiere a la expresión directa de un producto peptídico que tiene una glicina C-terminal que se convierte después de ello en un péptido amidado que tiene un grupo amino en lugar de dicha glicina. Descripción de la técnica relacionada Existen varias técnicas para la producción recombinante de productos peptídicos, es decir, cualquier compuesto cuya estructura molecular incluya una pluralidad de aminoácidos unidos por un enlace peptídico. Un problema cuando el producto peptídico exógeno es pequeño es que con frecuencia se degrada fácilmente por las proteasas endógenas en el citoplasma o periplasma de la célula huésped que se ha usado para expresar el péptido. Otros problemas incluyen alcanzar un rendimiento suficiente y recuperar el péptido en una forma relativamente pura sin alterar su estructura terciaria (lo que puede disminuir de forma indeseable su capacidad de realizar su función básica). Para salvar el problema del tamaño pequeño, el estado de la técnica con frecuencia ha expresado el producto peptídico de interés como una proteína de fusión con otro péptido (habitualmente mayor) y acumulado esta proteína de fusión en el citoplasma. El otro péptido puede servir para varias funciones, por ejemplo, para proteger el péptido de interés de la exposición a proteasas presentes en el citoplasma del huésped. Uno de tales sistemas de expresión se describe en Ray et al., Bio/Technology, Vol. 11, páginas 64-70, (1993). Sin embargo, el aislamiento del producto peptídico usando tal tecnología requiere el corte de la proteína de fusión y la purificación a partir de todos los péptidos normalmente presentes en el citoplasma del huésped. Esto puede necesitar un número de otros pasos que pueden disminuir la eficacia global del proceso. Por ejemplo, donde una proteína de fusión del estado de la técnica se acumula en el citoplasma, las células habitualmente se deben recoger y lisar, y eliminar los restos celulares en un paso de clarificación. Todo esto se evita según la presente invención en donde el producto peptídico de interés se expresa directamente en, y se recupera de, el medio de cultivo. En el estado de la técnica con frecuencia es necesario usar un paso de cromatografía de afinidad para purificar la proteína de fusión, que debe todavía experimentar corte para separar el péptido de interés de su compañero de fusión. Por ejemplo, en el artículo de Bio/Technology anteriormente identificado, el precursor de calcitonina de salmón se cortó de su compañero de fusión usando bromuro de cianógeno. Ese paso de corte aún necesitó pasos adicionales para proteger los grupos sulfhidrilo de las cisteínas en las posiciones 1 y 7 del precursor de calcitonina de salmón. Se usó sulfonación para proporcionar grupos protectores para las cisteínas. Eso a su vez alteró la estructura terciaria del precursor de calcitonina de salmón lo que necesitó la renaturalización posterior del precursor (y por supuesto la eliminación de los grupos protectores). El producto peptídico de la invención se expresa solo con una secuencia señal y no se expresa con un compañero de fusión grande. La presente invención produce la expresión directa. Inicialmente se expresa con una región señal unida a su extremo N-terminal. Sin embargo, esa región señal se corta postraduccionalmente durante la secreción del producto peptídico en el periplasma de la célula. Después de ello, el producto peptídico difunde o se excreta de otra manera del periplasma al medio de cultivo fuera de la célula, de donde se puede recuperar en la forma terciaria apropiada. No está unido a ningún compañero de fusión cuya eliminación requeriría primero lisar las células, desnaturalización o modificación, aunque en algunas formas de realización de la invención, se usa la sulfonación para proteger los grupos sulfhidrilo de cisteína durante la purificación del producto peptídico. Otro problema con la acumulación del producto peptídico según el estado de la técnica en el interior de la célula, es que el producto que se acumula puede ser tóxico para la célula y por tanto puede limitar la cantidad de proteína de fusión que se puede sintetizar. Otro problema con este planteamiento es que el compañero de fusión mayor habitualmente constituye la mayor parte de la producción. Por ejemplo, el 90% del rendimiento de producción puede ser el compañero de fusión mayor, lo que resulta de esta manera en solo el 10% del rendimiento que pertenece al péptido de interés. Aún otro problema con este planteamiento es que la proteína de fusión puede formar cuerpos de inclusión insolubles dentro de la célula, y la solubilización de los cuerpos de inclusión seguida por el corte puede no dar péptidos biológicamente activos. En el estado de la técnica se ha intentado expresar el péptido junto con un péptido señal unido al extremo N para dirigir el producto peptídico deseado para que se secrete en el periplasma (véase el documento EP 177.343, Genentech Inc.). Se han identificado varios péptidos señal (véase, Watson, M. Nucleic Acids Research, Vol. 12, No.13, pp: 5145-5164). Por ejemplo, Hsiung at al. (Biotechnology, Vol. 4, Noviembre 1986, pp: 991-995) usaron el péptido señal de proteína de membrana externa A (OmpA) de E. coli para dirigir ciertos péptidos al periplasma. Con 2   mayor frecuencia, los péptidos secretados al periplasma, tienden frecuentemente a permanecer allí con mínima excreción al medio. Se puede requerir un paso adicional indeseable para romper o permeabilizar la membrana para liberar cantidades suficientes de los componentes periplasmáticos. Algunos intentos del estado de la técnica para excretar péptidos del periplasma al medio de cultivo fuera de la célula han incluido comprometer la integridad de la barrera de la membrana externa al hacer que el huésped exprese de forma simultánea el producto peptídico deseado que contiene un péptido señal junto con una proteína péptido lítica que produce que la membrana plasmática se vuelva permeable o con fugas (patente de EE UU No. 4.595.658). Sin embargo, se necesita ser cuidadoso en la cantidad de producción de proteína péptido lítica para no comprometer la integridad celular y matar las células. La purificación del péptido de interés también se puede hacer más difícil por esta técnica. Aparte de las técnicas de desestabilización de la membrana externa descritas anteriormente hay medios menos rigurosos de permeabilizar la membrana externa de bacterias gram negativas. Estos métodos no producen necesariamente la destrucción de la membrana externa que puede producir menor viabilidad celular. Estos métodos incluyen, pero no están limitados al uso de agentes catiónicos (Martti Vaara., Microbiological Reviews, Vol. 56, páginas 395-411 (1992)) y glicina (Kaderbhai et al., Biotech. Appl. Biochem, Vol. 25, páginas 53-61 (1997)). Los agentes catiónicos permeabilizan la membrana externa interaccionando con y causando daño al esqueleto de lipopolisacárido de la membrana externa. La cantidad de daño y desorganización puede ser letal o no dependiendo de la concentración usada. La glicina puede sustituir a residuos de alanina en el componente peptídico del peptidoglicano. El peptidoglicano es uno de los componentes estructurales de la pared celular externa de las bacterias gram negativas. Al cultivar E. coli en una concentración alta de glicina aumenta la frecuencia de sustitución glicina-alanina lo que produce una pared celular defectuosa, y por tanto aumenta la permeabilidad. Otro método del estado de la técnica de producir la excreción de un producto peptídico deseado implica la fusión del producto a una proteína soporte que normalmente se excreta en el medio (hemolisina) o a una proteína entera expresada en la membrana externa (por ejemplo, la proteína ompF). Por ejemplo, la ß -endorfina humana se puede excretar como una proteína de fusión por células de E. coli cuando está unida a un fragmento de la proteína ompF (EMBO J., Vol. 4, No. 13A, pp: 3589-3592, 1987). Sin embargo, el aislamiento del producto peptídico deseado es difícil, ya que se tiene que separar del péptido soporte e implica alguna (aunque no todas) de las desventajas asociadas con la expresión de péptidos de fusión en el citoplasma. Aún otro planteamiento del estado de la técnica modifica genéticamente una célula huésped para... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de producir un péptido amidado que comprende: (a) cultivar células huésped de E. coli que comprenden un vector de expresión que comprende dos casetes de transcripción, en donde cada uno de dichos casetes de transcripción comprende: (i) una región codificante con ácidos nucleicos que codifican un producto peptídico acoplado en el mismo marco de lectura en 3 de ácidos nucleicos que codifican un péptido señal; y (ii) una región control operativamente unida con la región codificante, dicha región control comprende una pluralidad de promotores y al menos un sitio de unión a ribosomas, en donde al menos uno de dichos promotores es tac, en donde dichas células huésped expresan un producto peptídico que tiene una glicina C-terminal junto con un péptido señal N-terminal en condiciones en donde el crecimiento de dichas células huésped se controla para que esté dentro de un intervalo de 0,05 a 0,20 duplicaciones por hora; en donde el cultivo se induce durante parte del periodo de dicho crecimiento controlado; (b) recuperar dicho producto peptídico del medio de cultivo; y (c) convertir dicho producto peptídico a un péptido amidado convirtiendo dicha glicina C-terminal a un grupo amino. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha conversión a péptido amidado se alcanza mediante: (a) formación de una mezcla de reacción poniendo en contacto dicho producto peptídico con oxígeno y un agente reductor en presencia de peptidil glicina -amidante monooxigenasa, o peptidil glicina hidroxilante monooxigenasa; (b) si no se usa peptidil glicina -amidante monooxigenasa en el paso (a), y si la mezcla de reacción no es ya básica, entonces aumentar el pH de la reacción hasta que sea básico; y (c) recuperar dicho péptido amidado de dicha mezcla de reacción. 3. Un método para la expresión directa de un producto peptídico en un medio de cultivo que comprende los pasos de: (a) cultivar células huésped de E. coli que comprenden un vector de expresión que comprende dos casetes de transcripción, en donde cada uno de dichos casetes de transcripción comprende (i) una región codificante con ácidos nucleicos que codifican un producto peptídico acoplado en el mismo marco de lectura en 3 de ácidos nucleicos que codifican un péptido señal; y (ii) una región control operativamente unida con la región codificante, dicha región control comprende una pluralidad de promotores y al menos un sitio de unión a ribosomas, en donde al menos uno de dichos promotores es tac, en donde dichas células huésped expresan dicho producto peptídico junto con un péptido señal, en dicho medio, en condiciones en donde el crecimiento de dichas células huésped se controla para que esté dentro de un intervalo de 0,05 a 0,20 duplicaciones por hora; en donde está presente un inductor durante parte del periodo de dicho crecimiento controlado; y (b) recuperar dicho producto peptídico del medio de cultivo. 22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49

 

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