EPÍTOPOS ANTIGÉNICOS DEL FACTOR VIII, INHIBIDORES DIRIGIDOS CONTRA DICHOS EPÍTOPOS Y USO DE LOS MISMOS.

Epítopos antigénicos del factor VIII, inhibidores dirigidos contra dichos epítopos y uso de los mismos Objeto de la invención La presente invención se refiere a las secuencias de polipéptidos antigénicos (epítopos) del factor VIII, a los inhibidores anti-FVIII que se dirigen contra estas secuencias y a los anti-inhibidores que se dirigen contra dichos inhibidores anti-FVIII. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica y a un dispositivo de diagnóstico que comprende al menos una de las moléculas mencionadas anteriormente. Antecedentes técnicos que subyacen a la invención FVIII es una proteína multidominio grande de 2.332 aminoácidos constituida por tres dominios estructurales, A, B y C que se disponen en el orden A1:a1:A2:a2:B:a3:A3:C1:C2. Los dominios A poseen más del 40% de homología y son también homólogos a ceruloplasmina (para una revisión reciente, véase Pratt (2000) y Saenko (1999)). También existe un 30% de homología entre los dominios A del factor V y FVIII. El dominio C aparece dos veces y se ha notificado que puede unirse a glicoconjugados y fosfolípidos que tienen una carga negativa neta. Muestra homología con lectinas que pueden unirse a fosfolípidos cargados negativamente. Se ha ubicado en esta región el sitio de unión plaquetaria (dominio C2) (Foster et al., (1990)). Estos determinantes antigénicos consisten en los fragmentos 351-365 (dominio A1 - cadena pesada), 713-740 (dominio A2), 1670-1684 (dominio A3 cadena ligera) (extremo NH2 de la cadena ligera) o además 2303-2332 (dominio C2 - cadena ligera) (Foster C, (1990)), los fragmentos 701-750, 1663-1689, 330-472, 1694-1782 (documento EP-0 202 853), 322 - 740 y 2170 - 2322. La patente estadounidense 5.744.446 describe un factor VIII híbrido de ser humano/animal que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de los fragmentos del dominio A2 373-540, 373-508, 445-508, 484-508, 404-508, 489-508 y 484-489, con secuencias de factor VIII porcino o murino correspondientes, usándose dicho híbrido para el tratamiento de deficiencias de factor VIII. Los anticuerpos que reconocen estos diversos sitios interfieren con la activación del FVIII, la unión de vWf, FIXa, FXa, APC o fosfolípidos. La respuesta de anticuerpos específicos frente a FVIII varía considerablemente entre individuos, y los epítopos para anticuerpos inhibidores tienen que determinarse para todos los dominios de FVIII (véanse para una revisión reciente, Scandella, 2000; Lollar, 2000). Otros anticuerpos, que no inhiben pruebas de actividad convencional in vitro, pueden ejercer una influencia sobre el comportamiento de FVIII con los otros constituyentes de la cascada de coagulación mientras se unen ellos mismos a sitios en la molécula que están a una distancia sustancial de los sitios activos. Estos anticuerpos pueden interferir con el estado natural de plegamiento de FVIII alterando algunas de sus propiedades. El surgimiento de aloanticuerpos (inhibidores) que neutralizan la actividad de FVIII infundido puede complicar gravemente la terapia de restitución de FVIII. Las tasas de incidencia de inhibidores notificadas en hemofílicos varían considerablemente. Oscilan alrededor del 6-35% (Vermylen et al., 1998). Se han encontrado candidatos para predisposiciones genéticas tales como deleciones largas e inversiones del intrón 22 asociados con una alta incidencia de inhibidores y genes que están implicados en la respuesta inmunitaria como genes de MHC de clase I y clase II (Tuddenham y McVey, 1998). El intercambio repetido de un producto de FVIII por otro y la posibilidad de que algunos concentrados de FVIII sean más inmunogénicos también puede explicar la aparición de inhibidores (Vermylen et al., 1998). Diferentes métodos de preparación de FVIII podrían ejercer una influencia sobre su estructura, sus propiedades fisicoquímicas o su microentorno natural; Laub et al. (1999); Raut et al. (1998)). Autoanticuerpos anti-FVIII clínicamente relevantes son poco comunes en pacientes no hemofílicos (frecuencia anual en la población: 1-5/10 6 ) (Morrisson y Ludlam) (1995). Están asociados con varias enfermedades autoinmunitarias y a menudo se caracterizan por hemorragia potencialmente mortal. Por otro lado, también se han descrito anticuerpos anti-FVIII en sujetos sanos (Algiman et al., 1992; Moreau et al., 2000), sin ningún efecto aparente sobre los niveles de los sujetos de FVIII circulante. Los péptidos derivados o las proteínas propias pueden provocar una respuesta inmunitaria si se les presentan a células T CD4 en sitios inflamatorios por células presentadoras de antígenos profesionales. Usando conjuntos de péptidos sintéticos solapantes que abarcan las secuencias de dominios de FVIII individuales, Reding et al. (2000) mostraron CD4 + reactivos frente a FVIII en sujetos sanos y pacientes con hemofilia. Se reconocieron varios dominios de FVIII: el dominio A3 se reconocía más fuerte y frecuentemente y cada dominio forma varios epítopos. Técnicas tales como inmunotransferencia de tipo Western, immunoprecipitación y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), usando fragmentos proteolíticos de FVIII bien definidos, una gran biblioteca de péptidos recombinantes, o alineamientos de péptidos sintéticos, se han usado para mapear diferentes sitios de unión de inhibidor de FVIII ubicados principalmente en los dominios A2 y C2. Sin embargo, ninguna de estas técnicas ha 2   hecho posible la construcción de un modelo para la identificación de epítopos inhibidores y no inhibidores. Sólo algunos epítopos se han mapeado en secuencias diferenciadas (<20 residuos de aminoácido). Para solucionar este problema, Palmer et al. (1997) sintetizaron 96 péptidos undecámeros (11 residuos de aminoácido) que representaban el 80% de la secuencia de residuos completa de FVIII. Tuvieron éxito en la determinación de la especificidad de epítopo de anticuerpos inhibidores de 9 pacientes. Otras técnicas útiles son análisis de mutaciones génicas de FVIII y sus efectos en la molécula de FVIII así como la tecnología de presentación en fago (van den Brink et al., 2000). Todas estas metodologías, sin embargo, requieren mucho tiempo, son bastante costosas y dependen en gran medida de la disponibilidad del paciente. Ciertas zonas de la molécula de FVIII pueden ser puntos calientes que contienen agrupamientos de epítopos inhibidores comúnmente reconocidos, por ejemplo, regiones en el dominio A2, el dominio A3 y el dominio C2. El motivo de estos puntos calientes en la generación de una respuesta inhibidora sigue entendiéndose mal (Reisner et al., 1995). Actualmente, un concepto predominante entre pacientes hemofílicos, médicos y fraccionadores es el de tener disponible un FVIII purificado que carezca de todos los contaminantes plasmáticos patógenos y efectos secundarios. Podrían usarse diferentes modelos animales como perros con hemofilia, ratones scid, ratones con hemofilia... pero hasta ahora, no existe ningún modelo experimental satisfactorio que haga posible predecir la inmunogenicidad o el efecto inmunomodulador de las preparaciones de FVIII, o la susceptibilidad del huésped, antes de que se hayan administrado clínicamente. Los pacientes que desarrollan una respuesta inmunitaria anti-FVIII se encuentran por sí mismos en una situación grave que necesita el uso de medidas serias, agresivas y excesivamente caras. Uno de los tratamientos frecuentes es la inducción de tolerancia inmunitaria mediante la administración de dosis muy altas de FVIII (150 UI/kg dos veces al día) en asociación o no con concentrados de complejo de protrombina y se denomina protocolo de Bonn. Las opciones de tratamiento también son desviar la actividad inhibidora de FVIII mediante el uso de PCC (preferiblemente un PCC activado [APCC]) o FVIIa. Podrían producirse anticuerpos específicos como consecuencia de la infusión de estos agentes alternativos, alterando el tratamiento. Como agente alternativo, puede usarse FVIII porcino para lograr la hemostasia en pacientes con anticuerpos que no reaccionan de manera cruzada sustancialmente con FVIII porcino antes o durante el tratamiento (Lollar, 2000). Un posible enfoque alternativo para inhibir la producción de inhibidores es el bloqueo de la colaboración de células T/células B mediada a través de acontecimientos de señal de unión ligando-receptor (Ewenstein et al., 2000). Se realizaron ensayos clínicos preliminares usando un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado frente a un ligando de célula T CD40 humana (CD 154). Una estrategia fructífera para reducir el nivel de inhibidores ha consistido en someter a los pacientes a una circulación extracorpórea que permita la absorción en fase sólida de las IgG totales. El inmunoabsorbente podría ser proteína A de estafilococos unida a Sepharose o anticuerpos de oveja policlonales unidos a Sepharose frente... [Seguir leyendo]

1. Epítopo antigénico de la secuencia de polipéptido de FVIII comprendida entre isoleucina 2262 y glutamina 2270 inclusive, definida por la siguiente secuencia: 2. Conjunto de epítopos antigénicos de la secuencia de polipéptido del factor VIII que comprende el epítopo antigénico del factor VIII según la reivindicación 1 y uno o más epítopos antigénicos del factor VIII seleccionados del grupo que consiste en: - el epítopo arginina 1648 a tirosina 1664 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tetrapéptido Arg-Asp-Ile-Thr o uno o dos de los últimos aminoácidos del péptido Asp-Tyr - el epítopo ácido aspártico 1681 a arginina 1696 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del epítopo Asp-Glu-Asp-Glu - el epítopo treonina 1739 a tirosina 1748 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo asparagina 1777 a fenilalanina 1785 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o dos aminoácidos del dipéptido terminal Ser-Phe o el tetrapéptido Pro- Tyr-Ser-Phe - el epítopo ácido glutámico 1794 a tirosina1815 inclusive, definido por SEQ ID No: 5: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del primer tripéptido Glu-Asp-Gln o el primer nonapéptido Glu-Asp-Gln-Arg-Gln-Gly-Ala-Glu-Pro 22   - el epítopo metionina 1823 a ácido aspártico 1831, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo ácido glutámico 1885 a fenilalanina 1891 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo ácido glutámico 1885 a alanina 1901 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del heptapéptido Gly-Thr-Lys-Ser-Trp-Phe-Thr o del tripéptido Cys-Arg-Ala - el epítopo ácido aspártico 1909 a arginina 1917 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo comprendido entre serina 2018 e histidina 2031 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo alanina 108 a valina 128 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de los aminoácidos terminales alanina y/o valina - el epítopo ácido glutámico181 a leucina 192 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o dos aminoácidos del dipéptido terminal Thr-Leu - el epítopo ácido aspártico 203 a alanina 227 inclusive, definido por la siguiente secuencia: 23   posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del nonapéptido Asp-Arg-Asp-Ala-Ala-Ser-Ala-Arg- Ala - el epítopo ácido aspártico 327 a metionina 355 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del dipéptido Asp-Ser o el octapéptido Asp-Asp-Leu- Thr-Asp-Ser-Glu-Met - el epítopo ácido aspártico 403 a lisina 425 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tetrapéptido Asp-Asp-Arg-Ser - el epítopo valina 517 a arginina 527 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o los dos aminoácidos del dipéptido Pro-Arg - el epítopo tirosina 555 a glutamina 565 inclusive definido por la siguiente secuencia: - el epítopo histidina 693 a glicina 701 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo serina 710 a ácido aspártico 725 inclusive, definido por la siguiente secuencia: 24   - el epítopo leucina 730 a serina 741 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción del aminoácido terminal serina y/o el primer aminoácido leucina - el epítopo serina 817 a serina 830 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo isoleucina 2081 a serina 2095 inclusive, definido por la siguiente secuencia posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tetrapéptido Ile-His-Gly-ile - el epítopo tirosina 2105 a glicina 2121 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tripéptido Tyr-Ser-Leu - el epítopo ácido asparagina 2128 a ácido asparagina 2138 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo histidina 2152 a arginina 2163 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo serina 2181 a asparagina 2198 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tripéptido terminal Phe-Thr-Asn(P11)   - el epítopo serina 2204 a glutamina 2222 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo glutamina 2235 a leucina 2251 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o dos aminoácidos del dipéptido terminal Ser-Leu o uno o más aminoácidos del tetrapéptido Val-Lys-Ser-Leu - el epítopo glicina 2242 a leucina 2251 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o dos aminoácidos del dipéptido terminal Ser-Leu - el epítopo leucina 2273 a serina 2289 inclusive, definido por la siguiente secuencia: - el epítopo prolina 2292 a tirosina 2305 inclusive, definido por la siguiente secuencia: posiblemente con deleción de uno o más aminoácidos del tripéptido terminal Thr-Arg-Tyr - el epítopo ácido glutámico 2322 a tirosina 2332 inclusive, definido por la siguiente secuencia: 3. Epítopo conformacional que contiene al menos el epítopo según la reivindicación 1 y uno o más epítopos seleccionados del conjunto de epítopos de la reivindicación 2. 4. Factor VIII recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos en la que el epítopo antigénico según la reivindicación 1 y posiblemente uno o más epítopos adicionales seleccionados del conjunto de epítopos de la reivindicación 2 se deleciona(n). 5. Complejo que comprende una proteína portadora o un péptido portador unido a un epítopo según la reivindicación 1 ó 3. 6. Inhibidor de una secuencia de polipéptidos del factor VIII que se une al epítopo de la reivindicación 1 y posiblemente también al conjunto de epítopos de la reivindicación 2, o al epítopo conformacional de la reivindicación 3. 26 .   7. Inhibidor según la reivindicación 6, que es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-factor VIII. 8. Anti-inhibidor, que se dirige contra el inhibidor del factor VIII según la reivindicación 6 ó 7. 9. Anti-inhibidor según la reivindicación 8, que es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-idiotipo-antifactor VIII. 10. Composición farmacéutica, que comprende un portador farmacéutico adecuado y al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en el epítopo antigénico, el conjunto de epítopos, el complejo, el factor VIII recombinante, el inhibidor y/o el anti-inhibidor según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9. 11. Dispositivo de purificación y/o de diagnóstico, que comprende al menos un elemento que se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de epítopo, las secuencias del conjunto de epítopos, el complejo, el inhibidor y/o el anti-inhibidor según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9. 12. Dispositivo según la reivindicación 11, que es un kit de diagnóstico. 13. Dispositivo según la reivindicación 11, que es un filtro o una columna de cromatografía. 14. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento en el tratamiento y/o la prevención de hemofilia en un mamífero inducida por inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII. 15. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de hemofilia en un mamífero inducida por los inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII. 16. Método in vitro para el tratamiento de un fluido fisiológico (suero), obtenido de un paciente mamífero (incluyendo un ser humano), en el que dicho fluido fisiológico se pone dentro de la columna de cromatografía según la reivindicación 13 con el fin de permitir una unión de los inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII presentes en dicho fluido fisiológico con el epítopo, conjunto o complejo comprendido en dicha columna de cromatografía en el que tras la elución de la columna se recupera un fluido fisiológico sin inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII. 17. Procedimiento para identificar y obtener inhibidores y/o anti-inhibidores según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 6 a 9, que comprende las etapas de: - seleccionar un elemento del grupo que consiste en el epítopo, el conjunto de epítopos y/o el complejo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, unido a un soporte sólido (preferiblemente un soporte sólido de una columna de cromatografía), - hacer pasar un fluido fisiológico (suero) obtenido de un paciente que contiene inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII a través de dicha columna de cromatografía, - eluir dicha columna, y - recoger las fracciones que contienen inhibidores de secuencia de polipéptido del factor VIII que han mostrado una inmunoafinidad con dicho elemento. 18. Procedimiento según la reivindicación 16, que comprende además las etapas de: - unir los inhibidores recogidos del factor VIII sobre un soporte sólido (preferiblemente un soporte sólido de una columna de cromatografía), - hacer pasar un fluido fisiológico de un paciente mamífero que contiene anti-inhibidores del factor VIII sobre dicho soporte sólido, - lavar el soporte, preferiblemente eluyendo dicha columna, y - recoger las fracciones que contienen anti-inhibidores del factor VIII que han mostrado una inmunoafinidad con dichos inhibidores del factor VIII. 19. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 13, para purificar FVIII. 27   28   29     31   32