Procedimiento para el acoplamiento covalente de polisacáridos o moléculas de proteína.

Procedimiento para preparar una construcción que comprende un polisacárido y/o un oligosacárido acoplado por enlace covalente a una molécula de proteína,

comprendiendo dicho procedimiento:

despolimerizar dicho polisacárido y/o oligosacárido utilizando peróxido de hidrógeno en condiciones hidrolíticas suaves, generando de este modo un grupo de ácido carboxílico, en el que dichas condiciones suaves son una temperatura de 30ºC a 80ºC y un pH de 4,5 a 8,0 ± 0,10;

modificar el polisacárido despolimerizado y/o el oligosacárido con una molécula seleccionada de entre el grupo constituido por una amina y una hidrazida, en el que la modificación se lleva a cabo en presencia de una carbodiimida; y

conjugar dicho polisacárido y/o oligosacárido modificado y despolimerizado con grupos de ácido carboxílico de una molécula de proteína.

Procedimiento para el acoplamiento covalente de polisacáridos a moléculas de proteína.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para el acoplamiento covalente de polisacáridos y oligosacáridos a moléculas de proteína por despolimerización con peróxido de hidrógeno de las unidades de polisacárido, seguido de acoplamiento de la cadena de polisacárido despolimerizada a los grupos aminoácido de una proteína de interés mediante una molécula enlazadora.

Varias publicaciones hacen referencia a esta solicitud. La cita completa a estas publicaciones se encuentra donde se cita o al final de la memoria, que precede inmediatamente a las reivindicaciones. Estas publicaciones se refieren al estado de la técnica al que pertenece la invención; sin embargo, no existe reconocimiento de que alguna de estas publicaciones sea realmente la técnica anterior.

Antecedentes de la invención En los últimos años, ha existido un interés considerable en desarrollar métodos para acoplar por enlace covalente polisacáridos y oligosacáridos a moléculas de proteína. Este método se ha aplicado en el área de desarrollo de vacunas, donde polisacáridos capsulares bacterianos purificados se han acoplado por enlace covalente a moléculas de proteína (Dick, W. E. et al.; 1989) . Estas construcciones se han denominado vacunas conjugadas.

La razón para la preparación de estas construcciones es que los polisacáridos capsulares bacterianos purificados, que están clasificados como antígenos independientes de linfocitos T, pueden convertirse en antígenos similares a linfocitos T por acoplamiento covalente con determinadas moléculas de proteína. Las vacunas de polisacáridos no conjugados no pueden provocar una respuesta anamnésica en el hombre, y la respuesta inmunitaria a estos antígenos puede ser de duración limitada, especialmente en las poblaciones más jóvenes. Por esta razón, las vacunas de polisacáridos no han sido recomendadas para su utilización en poblaciones infantiles, debido a su eficacia limitada propia en esta población.

Durante los últimos diez a quince años, los polisacáridos capsulares purificados de Haemophilus influenzae tipo b se han unido por enlace covalente a numerosas moléculas de proteína, por ejemplo vacuna contra la difteria y proteína de la vacuna antitetánica, y estos conjugados son conocidos por provocar una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T en la población infantil. Esta característica ha permitido el desarrollo y obtención de licencias de vacunas eficaces contra la enfermedad producida por la bacteria Haemofilus influenzae tipo b (Santosham, M., 1993) . Este método de preparación de vacunas conjugadas se ha extendido también a otros polisacáridos capsulares, tales como los purificados a partir de Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae.

Objetivos y sumario de la invención Una ruta general que se ha utilizado para preparar estos conjugados de sacárido-proteína consiste en activar uno o más sitios en la cadena de sacárido de modo que estos sitios activados reaccionen con uno o más de los grupos aminoácido de la proteína.

En el desarrollo de una estrategia para acoplar por enlace covalente polisacáridos a proteínas, se describe una ruta en la que la cadena de polisacárido se despolimeriza inicialmente a oligosacáridos de peso molecular medio comprendido en el intervalo entre 10 y 30.000 por ejemplo, 10 a 25.000 daltons. Dos ventajas de la utilización de polisacáridos despolimerizados para preparar los conjugados son: (a) los conjugados preparados a partir de la utilización de polisacáridos despolimerizados puede ser propiamente más inmunógeno que los conjugados correspondientes preparados a partir de los polisacáridos completos; y (b) las reacciones utilizadas para preparar estas vacunas de conjugado pueden ofrecer un mayor grado de control, así como más versatilidad en el diseño del proceso, cuando se utilizan cadenas de polisacárido despolimerizadas frente a cadenas de polisacárido completas.

En algunos casos, se puede acoplar por enlace covalente las cadenas de polisacáridos despolimerizadas añadiendo un reactivo específico que permite la formación del enlace entre las moléculas de polisacárido y proteína. Dependiendo de la química que se utilice para llevar a cabo esta operación, pueden formarse uno o más enlaces entre el polisacárido y la proteína. En otros casos, se ha utilizado una ruta alternativa mediante la cual una pequeña molécula química se acopla al polisacárido despolimerizado o a la molécula de proteína, y esta molécula, debido a su propia reactividad, sirve como molécula enlazadora entre el polisacárido y la proteína. Estas moléculas se han denominado enlazadores químicos, enlazador y/o enlazador directo.

El procedimiento de la presente invención utiliza preferentemente éste último método, mediante el cual una molécula enlazadora se une a la cadena de polisacárido que proporciona el acoplamiento selectivo a grupos de aminoácido de la proteína. En este proceso, los polisacáridos se despolimerizan en primer lugar utilizando peróxido de hidrógeno en condiciones hidrolíticas suaves. La reacción de hidrólisis es un proceso bien controlado que proporciona una

distribución uniforme de cadenas de oligosacárido que reaccionan fácilmente con una hidrazida y/o una amina. El grado en el que la hidrazida o amina puede acoplarse a polisacáridos hidrolizados con peróxido de hidrógeno puede aumentarse mediante la adición de un compuesto reactivo de carbodiimida soluble en agua.

La razón de esta característica es que una determinada población de las cadenas de polisacárido despolimerizado posee un grupo químico que puede modificarse fácilmente con hidrazida o amina mediante la adición de carbodiimidas solubles en agua al medio de reacción. Estas cadenas de polisacárido resultantes modificadas por hidrazida/amina pueden unirse selectivamente a continuación a los grupos de ácido carboxílico de la proteína.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una construcción que comprende un polisacárido y/o un oligosacárido acoplado por enlace covalente a una molécula de proteína, comprendiendo dicho procedimiento despolimerizar dicho polisacárido y/o oligosacárido utilizando peróxido de hidrógeno en condiciones hidrolíticas suaves, generando de este modo un grupo de ácido carboxílico en el que dichas condiciones suaves son una temperatura entre 30º C y 80º C y un pH entre 4, 5 y 8, 0 ± 0, 10; modificar el polisacárido despolimerizado y/o el oligosacárido con una molécula seleccionada de entre el grupo que consiste en una amina y una hidrazida, en el que la modificación se lleva a cabo en presencia de una carbodiimida; y conjugar dicho polisacárido y/o oligosacárido modificado y despolimerizado con grupos de ácido carboxílico de una molécula de proteína.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción preparada según el procedimiento del primer aspecto.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición inmunológica, inmunógena o terapéutica que comprende la construcción según el segundo aspecto, en la que la construcción comprende un resto seleccionado de entre el grupo constituido por un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica y un factor de crecimiento, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en el que la proteína de dicha construcción puede provocar una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T en un hospedador inyectado con dicha proteína.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende la composición inmunológica del tercer aspecto.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a una construcción según el segundo aspecto para provocar una respuesta inmunológica en un vertebrado, en la que la construcción comprende un resto seleccionado de entre el grupo constituido por un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica y un factor de crecimiento.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una construcción según el segundo aspecto para tratar a un vertebrado necesitado de tratamiento, en la que la construcción comprende un resto seleccionado de entre el grupo constituido por un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica y un factor de crecimiento.

Las formas de realización preferidas de los aspectos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar una construcción que comprende un polisacárido y/o un oligosacárido acoplado por enlace covalente a una molécula de proteína, comprendiendo dicho procedimiento:

despolimerizar dicho polisacárido y/o oligosacárido utilizando peróxido de hidrógeno en condiciones hidrolíticas suaves, generando de este modo un grupo de ácido carboxílico, en el que dichas condiciones suaves son una temperatura de 30º C a 80º C y un pH de 4, 5 a 8, 0 ± 0, 10;

modificar el polisacárido despolimerizado y/o el oligosacárido con una molécula seleccionada de entre el grupo constituido por una amina y una hidrazida, en el que la modificación se lleva a cabo en presencia de una carbodiimida; y

conjugar dicho polisacárido y/o oligosacárido modificado y despolimerizado con grupos de ácido carboxílico de una 15 molécula de proteína.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es un polisacárido bacteriano capsular seleccionado de entre el grupo constituido por los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae y los grupos A, C, 14135 e Y de Neisseria meningitidis.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha despolimerización es a un peso molecular medio de 10 a 30.000 daltons.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha amina es el 1, 6-diaminohexano. 25

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha hidrazida es la dihidrazida adípica.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la carbodiimida es la 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)

carbodiimida. 30

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido y/o oligosacárido modificado y despolimerizado comprende una sola zona reactiva selectiva.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha conjugación comprende conectar directamente el

polisacárido y/o oligosacárido modificado y despolimerizado a un grupo de ácido carboxílico de la molécula de proteína.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha conjugación comprende además la utilización de un reactivo de carbodiimida soluble en agua en presencia de N-hidroxisuccinimida. 40

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho polisacárido modificado y despolimerizado es adicionalmente modificado con un enlazador bifuncional.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el reactivo de carbodiimida soluble en agua es la 1-etil-3- (345 dimetilaminopropil) -carbodiimida.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la construcción comprende un resto seleccionado de entre el grupo constituido por un epítopo de interés, un modulador de la respuesta biológica y un factor de crecimiento.

50 13. Construcción preparada de acuerdo con el procedimiento según la reivindicación 1.

14. Construcción preparada de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 12.

15. Composición inmunológica, inmunógena o terapéutica que comprende la construcción según la reivindicación 14

55 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en la que la proteína de dicha construcción puede provocar una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T en un hospedador inyectado con dicha proteína.

16. Vacuna que comprende la composición inmunológica según la reivindicación 15.

60 17. Construcción según la reivindicación 14, para provocar una respuesta inmunológica en un vertebrado.

18. Construcción según la reivindicación 14, para su utilización en medicina.