Complejo que comprende Vif y una proteína de interacción del VIH seleccionada de entre el grupo constituido por:

PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 14), CTCF (SEC ID nº 15), RPUhn ( SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos que pueden formar un complejo con Vif.

Dianas y compuestos para la intervención terapéutica de la infección por VIH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al campo técnico de la biología molecular y la virología, respectivamente, y al desarrollo de fármacos antivíricos en particular. En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para identificar y clonar moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una nueva clase de proteínas o fragmentos de las mismas, que pueden interactuar con proteínas asociadas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y que, de esta manera, resulten adecuados, solos o en un complejo con la proteína de VIH, como dianas para el desarrollo de fármacos antivíricos. En este contexto, la presente invención proporciona nuevas proteínas y complejos de interacción con el VIH. Otro objeto de la presente invención es un método para identificar y proporcionar fármacos anti-VIH que pueden modular la formación y/o estabilidad de un complejo de una proteína celular huésped humana con una proteína del VIH. De esta manera, la presente invención se refiere además a composiciones que resultan útiles para detectar y dirigirse a complejos entre proteínas del VIH y proteínas humanas, las cuales se cree que son esenciales en el establecimiento de la infección vírica.

Antecedentes de la invención

El SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, alcanzando su extensión proporciones de pandemia. En 1984 se descubrió el agente etiológico del SIDA como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , siendo un retrovirus que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. La familia Lentiviridae incluye los retrovirus no oncogénicos que habitualmente infectan las células del sistema inmunológico, en particular macrófagos y células T, causando infecciones persistentes en enfermedades con periodos de incubación prolongados y efectos citopáticos en las células infectadas, tales como la formación de sincitios y la muerte celular. Las infecciones por lentivirus no son eliminadas por el sistema inmunológico, y conducen a la acumulación de daños inmunológicos durante un periodo de muchos años.

El VIH que pertenece a la familia Lentiviridae es un retrovirus, es decir, contiene un genoma de ARN y actividad de transcriptasa inversa y, por lo tanto, durante su ciclo de crecimiento el VIH copia su ARN en ADN provírico, que puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped (provirus) . Debido a su naturaleza retrovírica y al pequeño tamaño de su genoma, la replicación del VIH es muy dependiente de la maquina celular del huésped. De esta manera, el VIH utiliza la maquinaria transcripcional y traduccional del huésped para expresar ARN y proteínas víricas y para finalmente liberar virus maduros de la célula mediante gemación de la membrana citoplasmática. En el caso del VIH, la replicación vírica resulta en la muerte de las células T ayudantes del huésped, lo que conduce a un estado de severa inmunodeficiencia (SIDA) , al desarrollo de diversas malignidades y a infecciones oportunistas, y en última instancia a la muerte del organismo infectado.

Aparte de los genes "habituales" del genoma del VIH, tales como env (codificante de la proteína de cubierta del virus) , gag (codificante de las proteínas internas responsables de la formación de las estructuras de cápside y nucleocápside) y pol (codificante de los enzimas transcriptasa inversa, integrasa y proteasa) , los genes transactivador transcripcional (tat) y regulador de la expresión vírica (rev) producen pequeñas proteínas no del virión que resultan esenciales para la replicación vírica. Además, varios genes que no participan en la expresión vírica se encuentran codificadas en VIH, tales como vif, vpr, vpu y nef.

El tratamiento de la enfermedad del VIH ha realizado avances significativos al reconocer que puede interferirse en el ciclo vital del VIH en muchos niveles, por ejemplo mediante la inhibición de la transcripción inversa del virus y mediante la inhibición de la actividad o fusión de su proteasa. Por consiguiente, se han desarrollado tres clases principales de fármacos: los inhibidores de la transcriptasa inversa, los inhibidores de proteasa y los inhibidores de fusión, y en la actualidad existen aproximadamente 25 fármacos antiretrovíricos aprobados para el tratamiento de los individuos infectados por el VIH. Además, es conocido que la combinación de fármacos diferentes con actividades específicas contra diferentes funciones bioquímicas del virus (terapia de combinación) puede ayudar a reducir el rápido desarrollo de virus resistentes a fármaco observado en respuesta a los tratamientos de un solo fármaco.

Sin embargo, incluso la actual "terapia antiretrovírica altamente activa" (HAART) , basada en un tratamiento de las personas infectadas con una combinación de fármacos antivíricos de por lo menos dos de las clases de fármaco anteriormente indicadas, y que hasta la actualidad es el único tratamiento eficaz para reducir el avance y extensión del SIDA, se asocia a varias desventajas y limitaciones al utilizarse a largo plazo, tales como el cumplimiento de un régimen de dosificación complejo, toxicidad de los efectos secundarios y el elevado coste; ver, por ejemplo, Richman, Nature 410:995-1001, 2001. Además, la elevada variabilidad genética y antigénica del VIH, debido a la elevada tasa de mutación de su genoma, en combinación con un cumplimiento inadecuado, es responsable de la resistencia de los fármacos HAART, lo que explica que la utilización de una HAART haya reducido en gran medida el número de muertes debidas al VIH/SIDA pero no haya conseguido la supresión vírica completa.

Además del desarrollo de inhibidores de los enzimas víricos "esenciales" (transcriptasa inversa, proteasa e integrasa) , la investigación se centra en la actualidad en las proteínas accesorias del VIH como dianas. Para las proteínas accesorias de VIH llamadas Vif, Vpu, Vpr y Nef, todavía se están investigando los mecanismos bioquímicos exactos; sin embargo, existe evidencia creciente que sugiere que ninguna de estas proteínas presenta actividad catalítica propia, sino que aparentemente funcionan a modo de "moléculas adaptadoras" que conectan otros factores víricos o celulares a diversas rutas celulares.

Una de las cuatro proteínas accesorias, el factor de infectividad del virión (Vif) , es una pequeña fosfoproteína básica con una masa molecular de 23 kDa que está compuesta de 192 aminoácidos y que se sintetiza de manera dependiente de Rev durante las últimas etapas de producción del virión. Existen homólogos de Vif en todos los lentivirus, con la sola excepción del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) ; ver Oberste y Gonda, Virus Genes 6:95-102, 1992, y los marcos de lectura abiertos de Vif están significativamente conservados en los diferentes lentivirus; ver Sonigo et al., Cell 42:369-382, 1985.

En el caso del VIH, Vif generalmente resulta necesaria para la replicación vírica en las células T primarias. Además, es conocido que contrarresta la supresión de la replicación del VIH mediada por una proteína huésped, la apolipoproteína B humana con actividad enzimática editora de ARNm de tipo polipéptido catalítico 3G (APOBEC3G) , que pertenece a la familia de enzimas de la citosina desaminasa APOBEC. Es conocido que APOBEC3G se empaqueta en los viriones retrovíricos (partículas víricas maduras infecciosas) y que desamina la desoxicitidina en desoxiuridina en el ADN vírico de cadena menos nuevamente sintetizado, induciendo de esta manera la hipermutación de G en A. La interacción de Vif con APOBEC3G en la célula productora de virus impide la incorporación de APOBEC3G en los viriones y, de esta manera, que APOBEC3G actúe sobre el ADNc del VIH recién sintetizado. Por el contrario se ha encontrado que Vig interactúa con las proteínas celulares Cul5, elogina B, elongina C, Rbx1, A3G, Cem15, SP140 (ver, por ejemplo, Yu et al., Science 302:1056-1060, 2003; patentes WO-A-2007/044565, WO-A-2005/023985, WO-A-2005/024422, WO-A-2005/004798; Bovolenta, Current Drug Targets, Immune, Endocrine and Metabolic Disorders, Bentham Science Publishers 4 (4) :257-263, 2004; Baraz et al., Current Medicinal Chemistr y 11 (2) :221-231, 2004; Chiu et al., Trends in Immunology 27 (6) :291-297, 2006; Navarro et al., Current Opinion in Immunology 16 (4) :477-482, 2004; Madani et al., Journal of Virology 76 (21) :11133-11138, 2002) , induciendo de esta manera, tras su unión a APOBEC3G, su ubiquitinación y degradación proteosómica y finalmente la eliminación de APOBEC3G... [Seguir leyendo]

1. Complejo que comprende Vif y una proteína de interacción del VIH seleccionada de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5) , HERC4 (SEC ID nº 6 y 7) , Tom1L1 (SEC ID nº 8) , EIF4A2 (SEC ID nº 9) , TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13) , NUP50 (SEC ID nº 14) , CTCF (SEC ID nº 15) , RPUhn (SEC ID nº 16) , MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17) , SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19) , PTGES3 (SEC ID nº 20) , HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos que pueden formar un complejo con Vif.

2. Método para cribar compuestos, que puede modular la formación de un complejo y/o la estabilidad de un complejo, que comprende las etapas que consisten en:

a) someter un compuesto de ensayo a:

i) la proteína Vif diana del VIH y una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5) , HERC4 (SEC ID nº 6 y 7) , Tom1L1 (SEC ID nº 8) , EIF4A2 (SEC ID nº 9) , TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13) , NUP50 (SEC ID nº 14) , CTCF (SEC ID nº 15) , RPUhn (SEC ID nº 16) , MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17) , SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19) , PTGES3 (SEC ID nº 20) , HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos, o ii) el complejo según la reivindicación 1;

b) monitorizar los cambios en la formación de un complejo y/o en la estabilidad de un complejo, y c) determinar un compuesto que puede modular la formación y/o estabilidad de un complejo basándose en su capacidad de modificar la formación de complejos entre las proteínas de (i) y/o modificar la estabilidad de (ii) en comparación con un control.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la proteína diana del VIH es una proteína de fusión que comprende glutatión-S-transferasa, preferentemente, en el que la proteína humana se marca co.

35. metionina.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la formación de un complejo resulta de la interacción proteínaproteína en un sistema a base de células de dos o tres híbridos.

5. Método para preparar, detectar y analizar el complejo según la reivindicación 1, que comprende las etapas que consisten en:

a) sintetizar y/o aislar la proteína del VIH; b) sintetizar y/o aislar la proteína humana; c) poner en contacto las proteínas de a) y b) ; d) monitorizar la formación de un complejo; y opcionalmente e) determinar las características del complejo (estabilidad o cinética) mediante métodos in vitro conocidos.

6. Kit o sistema de ensayo para la utilización en los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, comprendiendo dicho kit o sistema de ensayo la proteína diana (Vif) y una o más proteínas candidatas (huésped) seleccionadas de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5) , HERC4 (SEC ID nº 6 y 7) , Tom1L1 (SEC ID nº 8) , EIF4A2 (SEC ID nº 9) , TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13) , NUP50 (SEC ID nº 14) , CTCF (SEC ID nº 15) , RPUhn (SEC ID nº 16) , MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17) , SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19) , PTGES3 (SEC ID nº 20) , HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) , o que comprende las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes codificantes de la proteína diana (Vif) y una o más proteínas candidatas (huésped) de las mencionadas anteriormente, y que comprende opcionalmente reactivos, herramientas de automatización, dispositivos de almacenamiento, robots de manipulación de líquidos o disposiciones de monitorización.