PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN Y/O DE CUANTIFICACIÓN Y/O DE IDENTIFICACIÓN IN VITRO DE BACTERIAS EN UN MATERIAL BIOLÓGICO.

Procedimiento de detección y/o de cuantificación y/o de identificación in vitro de bacterias presentes en un medio fluido M que constituye un material biológico,

procedimiento en el que, de forma conocida, se prepara una suspensión, en un medio líquido de suspensión, de microbolas delimitadas por una superficie externa constituida por un material polimérico sólido susceptible de fijar proteínas, caracterizado por el hecho de que consta de las etapas siguientes:

a) en un tampón apropiado, se asegura una carga de microbolas de la suspensión con proteínas 12GPI por acoplamiento con una cantidad suficiente de proteínas 12GPI, bien de forma pasiva en un medio de suspensión, bien utilizando un protocolo de unión química conocido;

b) se ponen en contacto, en un contenedor, dichas microbolas cargadas con proteínas 12GPI con el medio fluido M en las condiciones apropiadas para asegurar, sin la presencia de iones de metal oxidante, una fijación suficiente de las bacterias sobre las proteínas 12GPI contenidas en las microbolas;

c) se separan las microbolas así preparadas de su medio de suspensión, se evacua dicho medio de suspensión fuera del contenedor para obtener un residuo con una alta concentración de bacterias;

d) y se detectan y/o cuantifican y/o identifican las bacterias del residuo.

Procedimiento de detección y/o de cuantificación y/o de identificación in vitro de bacterias en un material biológico.

La presente invención se refiere a un procedimiento de detección y/o de cuantificación y/o de identificación in vitro de bacterias en un material biológico.

En la presente descripción, se entiende por "material biológico" un tejido biológico, una preparación o un extracto obtenido de tejido biológico, líquido o sólido, o un medio, natural o no, susceptible de contener bacterias, por ejemplo, un agua de flujo o un agua de lavado de frutas y legumbres. Dicho material también puede ser una mezcla de al menos dos materiales tales como se han definido anteriormente; puede prepararse, por lo tanto, principalmente, a partir de tejidos, de órganos, de sales o de líquidos biológicos de un enfermo que padece una afección u obtenerse a partir de cultivos "in vitro"; dicho material biológico puede ser también un suero, plasma, orina, líquido céfalo-raquídeo, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido seminal o líquido ascítico.

Ya se ha descrito una glicoproteína plasmática denominada 12-glicoproteína I, o también abreviado "12GPI"; la secuencia de esta glicoproteína humana se ha indicado principalmente en los artículos de J. LOZIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p. 3640-3644 (julio 1984) y de T. KRISTENSEN et al., FEBS Letters, Vol. 289, p. 183186 (1991) . Se ha constatado que esta proteína 12GPI presenta un polimorfismo: la denominación 12GPI se considerará de ahora en adelante en este texto como genérica para todas las formas.

En la solicitud internacional WO 94/18569, se ha indicado que determinados compuestos infecciosos, en particular proteínicos, se fijaban sobre la forma de 12GPI que se había descrito en la patente francesa 2 701 263. Se ha propuesto en el documento WO 94/18569, un procedimiento de detección y/o de dosificación de compuestos virales en el que se fijan los compuestos infecciosos virales sobre la forma de 12GPI utilizada; se añade por lo tanto esta forma de 12GPI sobre los compuestos infecciosos virales contenidos en un material biológico, de forma que se separan los compuestos virales así capturados para detectarlos y/o dosificarlos. En la patente europea EP 775 315, se ha descrito la formación de un complejo entre un compuesto infeccioso, en particular proteínico, y una forma cualquiera de 12GPI; pudiendo ser el compuesto infeccioso, principalmente, una bacteria. De estos documentos se desprende que la 12GPI es susceptible de fijarse sobre un soporte sólido plano, tal como los fondos de pocillos de una placa de microtitulación, y que la 12GPI así capturada sobre este soporte sólido plano, es susceptible de fijar las bacterias presentes en muestras clínicas, biológicas o medioambientales con concentraciones muy bajas. Se sabe, además, que dichas muestras pueden contener sustancias que inhiben, al menos parcialmente, la detección de los patógenos, sustancias que, consecuentemente, pueden disminuir la sensibilidad de la detección. Es por lo tanto importante poder capturar y concentrar estos patógenos para eliminar las sustancias que inhiben su puesta de manifiesto.

Los estudios de la empresa solicitante han mostrado que la fijación de la 12GPI sobre el fondo de pocillos de placas de titulación, se hacía gracias a una conformación particular de la 12GPI, conformación que permitía posteriormente la formación de un complejo de la 12GPI con un compuesto infeccioso. La bibliografía ha destacado por otra parte que la conformación de la 12GPI variaba con su fijación sobre una superficie sólida (Matsuura et al., J. Exp. Med. 179, p. 457-462 (1994) ) . Ya se había descrito (A. IWATA et al., Biol. Pharm. Bull. 26 (8) , p. 1065-1069 (2003) ) un procedimiento de concentración de virus utilizando microbolas magnéticas sulfonadas sobre las que los virus quedaban capturados, obteniéndose la concentración de los virus gracias al hecho de que las microbolas eran magnéticas y podían separarse del medio infeccioso por acción de un campo magnético. Desgraciadamente, el resultado de esta técnica era esencialmente función de la captura de los virus sobre las microbolas. Este documento explica de forma detallada que determinados virus sin cubierta no se fijan sobre las bolas de polietilenimina y que es necesario utilizar microbolas sulfonadas para concentrar determinados virus. Además, para determinados virus, era necesario añadir en el medio cationes divalentes. Resulta de esta constatación que, según la naturaleza del virus, el polímero que constituye las microbolas debe ser diferente, injertado o no, y que los iones divalentes son necesarios o no; las bolas deben prepararse, por lo tanto, una por una en función del virus a concentrar. Las mismas constataciones resultan del documento E. UCHIDA et al., Journal of Virological Methods, 143, p. 95-103 (2007) , que se refiere a la concentración de los virus de las hepatitis A, B, C humanas. En presencia de una muestra que contiene un virus no identificado a detectar, no es posible determinar qué naturaleza de las microbolas es susceptible de proporcionar un lugar para una captura del virus de interés.

Consecuentemente, habida cuenta los inconvenientes que existen para la fijación de virus sobre las microbolas, un experto en la técnica no se inclinaría a investigar una fijación de bacterias sobre microbolas. La empresa solicitante, sin embargo, ha estado en contra de este prejuicio desfavorable proponiendo, según la presente invención, interponer, entre una microbola y una bacteria a fijar encima, una molécula de 12GPI. El estado de la técnica ha permitido determinar la naturaleza de los soportes sólidos que permiten una buena captura de la 12GPI; la fijación de la 12GPI sobre la microbola se efectúa sin que el polímero de la microbola se haya modificado en función de la bacteria a fijar posteriormente. Y, además, se ha constatado que la fijación de la 12GPI sobre la microbola no perturbaba la captura de la bacteria sobre la 12GPI; ahora bien, este último punto era totalmente inesperado porque no se podía prever que la conformación de la 12GPI fijada sobre una microbola permitiría la captura de un agente patógeno sobre la glicoproteína. Por cierto y a título complementario, un elemento disuasivo para resultar en la invención provenía del hecho de que se sabía que la 12GPI tenía una tendencia a auto-polimerizarse (véase: Thrombosis Research, 108, p. 175-180 (2003) ) , lo que tiene el riesgo de comportar una aglutinación de las microbolas portadoras de 12GPI, aglutinación que, por supuesto, hace impensable la fijación de agentes patógenos sobre las moléculas de 12GPI.

La presente invención tiene, consecuentemente, por objeto un procedimiento de detección y/o de cuantificación y/o de identificación in vitro de bacterias presentes en un medio fluido M que constituye un material biológico, procedimiento en el que, de forma conocida, se prepara una suspensión, en un medio líquido de suspensión, de microbolas delimitadas por una superficie externa constituida por un material polimérico sólido susceptible de fijar proteínas, caracterizado por el hecho de que consta de las etapas siguientes:

a) en un tampón apropiado, se asegura una carga de microbolas de la suspensión con proteínas 12GPI por acoplamiento con una cantidad suficiente de proteínas 12GPI, bien de forma pasiva en un medio de suspensión, bien utilizando un protocolo de unión química conocido;

b) se ponen en contacto, en un contenedor, dichas microbolas cargadas con proteínas 12GPI con el medio fluido M en las condiciones apropiadas para asegurar, sin la presencia de iones de metal oxidante, una fijación suficiente de las bacterias sobre las proteínas 12GPI contenidas en las microbolas;

c) se separan las microbolas así preparadas de su medio de suspensión, se evacua dicho medio de suspensión fuera del contenedor para obtener un residuo con una alta concentración de bacterias;

d) y se detectan y/o cuantifican y/o identifican las bacterias del residuo.

Ha sido completamente sorprendente constatar que, cuando se aplica el procedimiento definido anteriormente y se lavan las microbolas que constituyen el residuo con una alta concentración de bacterias, las bacterias captadas por las microbolas conservan su capacidad de multiplicación. En un modo ventajoso de aplicación, el procedimiento según la invención se caracteriza por lo tanto por el hecho de que se lavan las microbolas que constituyen el residuo, se ponen en contacto con un medio de cultivo susceptible de permitir su multiplicación y, de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección y/o de cuantificación y/o de identificación in vitro de bacterias presentes en un medio fluido M que constituye un material biológico, procedimiento en el que, de forma conocida, se prepara una suspensión, en un medio líquido de suspensión, de microbolas delimitadas por una superficie externa constituida por un material polimérico sólido susceptible de fijar proteínas, caracterizado por el hecho de que consta de las etapas siguientes:

a) en un tampón apropiado, se asegura una carga de microbolas de la suspensión con proteínas 12GPI por acoplamiento con una cantidad suficiente de proteínas 12GPI, bien de forma pasiva en un medio de suspensión, bien utilizando un protocolo de unión química conocido;

b) se ponen en contacto, en un contenedor, dichas microbolas cargadas con proteínas 12GPI con el medio fluido M en las condiciones apropiadas para asegurar, sin la presencia de iones de metal oxidante, una fijación suficiente de las bacterias sobre las proteínas 12GPI contenidas en las microbolas;

c) se separan las microbolas así preparadas de su medio de suspensión, se evacua dicho medio de suspensión fuera del contenedor para obtener un residuo con una alta concentración de bacterias;

d) y se detectan y/o cuantifican y/o identifican las bacterias del residuo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que se lavan las microbolas que constituyen dicho residuo, se ponen en contacto con un medio de cultivo susceptible de permitir su multiplicación y, de forma conocida, se detectan y/o cuantifican y/o identifican las bacterias a partir de dicho medio de cultivo.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que para permitir la multiplicación de las bacterias del medio M fijadas sobre las microbolas, se asegura su incubación en el medio de cultivo durante un tiempo y a una temperatura apropiados.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el medio fluido M es un hemocultivo.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que después de haber obtenido el residuo con una alta concentración de bacterias, se vuelven a poner las microbolas en suspensión en un caldo Tripticasa-Soja y se deposita este caldo en un medio de cultivo con sangre de carnero.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que se identifican las bacterias por coloración Gram y/o por subcultivos sobre medio selectivo o no.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que se cuantifican las bacterias por lectura de la densidad óptica, por ATP-metría o por PCR del lisado.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que se elige el material sólido constitutivo de la superficie externa de las microbolas del grupo formado por las materias plásticas y los elastómeros, conteniendo o no dicho material grupos reactivos injertados sobre la superficie externa de las microbolas para asegurar una unión química con las proteínas 12GPI.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que se eligen las microbolas que tienen una forma sensiblemente esférica y un diámetro medio comprendido entre 1 y 100.000 nm.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que se eligen las microbolas que tienen un núcleo formado por una (o varias) partícula (s) de material magnético para permitir su separación respecto del medio de suspensión gracias a un campo magnético.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que se separan las microbolas de su medio de suspensión por centrifugación.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que se efectúa la carga de las microbolas con proteínas 12GPI poniéndolas en un medio líquido de suspensión que contiene, en disolución acuosa, de 10-6 a 100 mg de 12GPI por gramo de peso seco de microbolas, estando comprendida la concentración de 12GPI del medio entre 10-5 y 10 !g/!l y agitando la suspensión así constituida durante 15 a 60 minutos a una temperatura comprendida entre 300C y 450C.