Constructos de ARN.

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) aislado con una longitud de al menos 80 pares de bases eficaz en la silenciación génica por ARNi,

En el que el ARNds comprende al menos dos fragmentos de ARNds de al menos 17 pares de bases, comprendiendo cada fragmento hebras complementarias hibridadas, en la que cada fragmento de ARNds comprenden una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana, en la que:

(i) cada fragmento de ARNds comprende una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana diferente, en la que diferentes secuencias diana se originan:

(a) de un único gen diana, en el que los fragmentos de ARNds se mezclan y combinan deliberadamente en cualquier orden de clasificación en el ARNds y en el que los fragmentos de ARNds no se combinan en el orden original en el que los fragmentos aparecen en el gen diana, o

(b) de genes diana diferentes en una única especia diana o en especies diana diferentes, o

(c) de especies diana diferentes, o

(ii) dicho ARNds comprende (a) al menos dos copias de un fragmento de ARNds o (b) al menos dos copias de una serie de fragmentos de ARNds.

Constructos de ARN

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la silenciación génica mediada por ARN bicatenario (ARNds) . Más particularmente, la presente invención se refiere a construcciones genéticas diseñadas para ser más eficaces en la silenciación con ARNds usando múltiples secuencias diana como objetivo.

Estas construcciones son particularmente útiles en el control de plagas en plantas mediado por dsARN.

Antecedentes de la invención

En la técnica se han descrito muchas construcciones de ARNds. Un ARNds clásico se produce a partir de una construcción de ADN que comprende dos promotores convergentes que flanquean a la secuencia complementaria a la secuencia diana que tiene que regularse por disminución (Véase, por ejemplo, el documento WO00/01846) . A medida que avanzaba la tecnología de la silenciación génica mediada por dsARN, se diseñaron nuevas construcciones para mejorar el dsARN para varios fines.

Con el fin de producir el dsARN con más eficiencia se desarrolló una estructura de tallo-bucle-talo o “en horquilla”. Como se ha descrito en, por ejemplo, el documento W099/53050, esta horquilla permite la formación de un dsARN a partir de un solo tránscrito de ARN. El tránscrito de ARN comprende la versión sentido y antisentido de la secuencia complementaria, separadas por una estructura no complementaria en bucle, lo que permite que se vuelva a plegar el tránscrito de ARN y el par de bases en la porción de tallo del dsARN.

Con el fin de producir dsARN que sea más eficaz en la silenciación génica, se incorporaron en una construcción múltiples copias de la secuencia complementaria a la secuencia diana y se convirtieron en un dsARN. En el documento W099/49029 se describe con más detalle un gen sintético que comprende múltiples secuencias génicas estructurales, en el que cada secuencia génica estructural es sustancialmente idéntico a la del gen Diana.

El documento W02004/001 013 describe construcciones diseñadas especialmente para su uso en aplicaciones clínicas para la prevención o tratamiento de enfermedades o infecciones sin generar efectos secundarios adversos debido a toxicidad inducida por dsARN. Se ha descrito que algunos dsARN puede inducir una respuesta de interferón que puede conducir a la muerte celular (y col. Cancer Invest. 13: 327-338, 1995) . Estas construcciones se caracterizan por restos que son sensibles al procesamiento del ARN con el fin de mejorar la formación de ARN de interferencia cortos (ARNsi) que participan en la silenciación génica evitando la toxicidad del dsARN causada por un dsARN (más de 30 pares de bases) . Los ARN de interferencia cortos (ARNsi) participan en la escisión de ARN diana monocatenarios específicos. Normalmente estos ARNsi tienen aproximadamente 21 nt de longitud, lo que sugiere que la expresión de ARNsi en el huésped produce una regulación por disminución eficiente y específica de la expresión génica, lo que tiene como resultado la inactivación funcional de los genes diana.

La silenciación génica del ARNds encuentra aplicación en muchas áreas diferentes, tales como, por ejemplo, la silenciación génica mediada por ARNds en plantas. Silenciación génica del ARNds también encuentra aplicación en el campo del control de plagas de plantas (documento WO 00/01864) . En general, el organismo de la plaga se erradica mediante la captación del Arnés, capaz de silenciar la expresión de un gen diana, expresión que es necesaria para la viabilidad, crecimiento y/o desarrollo de las especies de plagas. Poner en contacto los organismos de plaga con el ARNds se puede producir de varios modos, un ejemplo de los cuales es la producción del ARNds dentro de la célula vegetal afectada por el organismo de la plaga.

Un problema con la expresión del Arnés en plantas es que se puede procesar con la maquinaria de procesamiento de ARN de la célula vegetal (Susi y col., 2004. PMB 54: 157-174, Baulcombe, 2004. Nature 431: 356-363) .

Lave y col., 2002 (The Plant Cell 14: 1605-1619) , describen la identificación de ARN pequeños endógenos de principalmente 21 a 24 nucleótidos en plantas, particularmente Arabidopsis.

Myers y col., 2003 (Nature Biotechnology 21: 324-328) , describen la producción de ARNsi de 20 a 21 pares de bases in vitro usando formas recombinantes purificadas de la enzima Dícer. Se demostró que los ARNsi generados con Dícer eran eficaces en la silenciación de los genes indicadores transfeccionados de forma transitoria y de genes endógenos.

Sumario de la invención

Aunque se desea la formación de ARN de interferencia cortos (ARNsi) de aproximadamente 21 nt para la silenciación génica, ahora los presentes inventotes han descubierto que la longitud mínima del ARNds tiene que ser de al menos 80-100 nt para que pueda ser captado con eficiencia por el organismo productor de la plaga. Hay

indicaciones de que en invertebrados, como el nematodo de vida libre C. elegans o el nematodo parásito de plantas Meloldogyne incognita, estos fragmentos más largos son más eficacies en la silecniación génica, posiblemente debido a una captación más eficiente de estos ARNds largos por los invertebrados.

La presente invención aborda este problema proporciona constructos de ARNds que son eficientes en la silenciación génica mediada por ARNds, al tiempo que retienen longitud suficiente.

Además, la presente invención proporciona un diseño del Arnés del concatémero, lo que permite combinar varios fragmentos cortos en un constructo de ARNds más largo y permite incrementar la eficacia del control de la viabilidad, el crecimiento y/o el desarrollo de las plagas.

La presente invención proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) aislado con una longitud de al menos 80 pares de bases eficaz en la silenciación génica por ARNi, En el que el ARNds comprende al menos dos fragmentos de ARNds de al menos 17 pares de bases, comprendiendo cada fragmento hebras complementarias hibridadas, en la que cada fragmento de ARNds comprenden una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana, en la que:

(i) cada fragmento de ARNds comprende una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana diferente, en la que diferentes secuencias diana se originan:

(a) de un único gen diana, en el que los fragmentos de ARNds se mezclan y combinan deliberadamente en cualquier orden de clasificación en el ARNds y en el que los fragmentos de ARNds no se combinan en el orden original en el que los fragmentos aparecen en el gen diana, o

(b) de genes diana diferentes en una única especia diana o en especies diana diferentes, o

(c) de especies diana diferentes, o

(ii) dicho ARNds comprende (a) al menos dos copias de un fragmento de ARNds o (b) al menos dos copias de una serie de fragmentos de ARNds.

Los constructos descritos en el presente documento y adecuados para un eficiente control de plagas mediado por ARNds se diseñan para cumplir al menos algunos de los requisitos siguientes (1) el constructor de ARNds tiene buena estabilidad en la célula huésped que produce el ARNds (2) el ARNds es captado por los organismos productores de la plaga (3) el ARNds tiene buena estabilidad en los organismos productores de la plaga y/o (4) el ARNds es eficaz en el organismo productor de la plaga para controlar su viabilidad, crecimiento y/o desarrollo.

Estos diseños de constructos de ARNds tienen una o más de las ventajas siguientes:

(1) Los constructos de concatémeros de la presente invención permiten la incorporación de múltiples fragmentos de ARNds para apuntar a múltiples secuencias diana o genes diana de forma simultánea. Estas múltiples secuencias diana o genes diana se pueden originar de la misma o de diferentes especies de plagas. Estas múltiples secuencias diana o genes diana pueden ser ortólogos u homólogos o pueden estar no relacionados. Como alternativa, los constructos de concatémeros permiten la incorporación de múltiples fragmentos de ARNds dirigidos contra una o más partes de un gen diana;

(2) los constructos de la presente invención permiten el desarrollo de ARNds cuya longitud y/o tamaño y/o forma es compatible con suficiente... [Seguir leyendo]

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) aislado con una longitud de al menos 80 pares de bases eficaz en la silenciación génica por ARNi, En el que el ARNds comprende al menos dos fragmentos de ARNds de al menos 17 pares de bases, comprendiendo cada fragmento hebras complementarias hibridadas, en la que cada fragmento de ARNds comprenden una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana, en la que:

(i) cada fragmento de ARNds comprende una hebra que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de una secuencia diana diferente, en la que diferentes secuencias diana se originan:

(a) de un único gen diana, en el que los fragmentos de ARNds se mezclan y combinan deliberadamente en cualquier orden de clasificación en el ARNds y en el que los fragmentos de ARNds no se combinan en el orden original en el que los fragmentos aparecen en el gen diana, o

(b) de genes diana diferentes en una única especia diana o en especies diana diferentes, o

(c) de especies diana diferentes, o

(ii) dicho ARNds comprende (a) al menos dos copias de un fragmento de ARNds o (b) al menos dos copias de una serie de fragmentos de ARNds.

2. Un ARNds aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos al menos dos fragmentos de ARNds no están separados por una región no complementaria.

3. Un ARNds aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho ARNds comprende (i) al menos dos copias de un fragmento de ARNds o (ii) al menos dos copias de una serie de fragmentos de ARNds.

4. Un ARNds aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos al menos dos fragmentos de ARNds son (i) repeticiones de un fragmento de ARNds o (ii) repeticiones de una serie de fragmentos de ARNds.

5. Un ARNds aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, que comprende al menos un fragmento de ARNds que es distinto de los fragmentos repetidos.

6. Un ARNds aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha especie diana diferente pertenece al mismo género, familia u orden.

7. Un ARNds aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha especie diana diferente pertenece a un género, familia, orden o filo diferente.

8. Un ARNds aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia diana o el gen diana procede de un organismo de plaga de plantas.

9. Un ARNds aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la porción de ARNds tiene una longitud entre aproximadamente 80 pares de bases y aproximadamente 500 pares de bases.

10. Un ácido desoxiribonucleico aislado que codifica un ARNds de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un constructo de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Un constructo de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende además una secuencia reguladora unida operablemente a dicho ácido nucleico.

13. Un constructo de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la secuencia reguladora se selecciona del grupo que comprende promotores constitutivos tal como cualquier seleccionado del grupo que comprende el promotor de CaMV35S , el promotor doble de CaMV35S, el promotor de la ubiquitina, el promotor de la actina, el promotor rubisco, el promotor de GSO2, el promotor 34 S del virus del mosaico de la celedonia (FMV) ; o promotores específicos de tejido, tale como cualquiera seleccionado del grupo que comprende promotores específicos de la raíz de genes que codifican la quitinasa de clase III de PsMRA, los promotores específicos de tejidos fotosintéticos tales como los promotores de las proteínas cab1 and cab2, rbcS, gapA, gapB y ST-LS1, los promotores JAS, el promotor de la chalcona sintasa y el promotor de RJ39 de la fresa.

14. Un constructo de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, en el dicho ácido nucleico se clona entre dos secuencias reguladoras que están en dirección opuesta una respecto a la otra, dichas secuencias reguladoras operablemente unidas a dicho ácido nucleico y dichas secuencias reguladoras seleccionadas de forma independiente del grupo que comprende una ARN Poll, una ARN PolIl, una ARN PolIll, ARN polimerasa de T7 o ARN polimerasa de SP6.

15. Una célula huésped que comprende un ARNds de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico de la reivindicación 10 o un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

16. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15, que se escoge de una célula bacteriana, una célula de levadura y una célula vegetal.

17. Una planta transgénica, material reproductor o de propagación para una planta transgénica que comprende una célula vegetal de la reivindicación 16.

18. Una planta que comprende un ARNds de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, al menos un ácido nucleico de la reivindicación 10 o al menos un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

19. Una semilla que comprende al menos un ácido nucleico de la reivindicación 10 o al menos un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

20. Un procedimiento para la producción de una célula vegetal o planta transgénica, que comprende la etapa de administrar un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 a dicha célula vegetal

o planta.

21. Una composición farmacéutica que comprende al menos un ARNds de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente fisiológicamente o agronómicamente aceptable.

22. Una composición que comprende al menos un ácido nucleico de la reivindicación 10 o un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 y un excipiente fisiológicamente o agronómicamente aceptable.

23. Uso de una composición de la reivindicación 21 como pesticida para una planta o para material de propagación o reproductor de una planta.

24. Un procedimiento para tratar y/o prevenir el crecimiento de plagas y/o la infestación de plagas de una planta o material de propagación o reproductor de una planta, que comprende aplicar una cantidad eficaz de un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones a 1 9, o una composición de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22 a una planta o al material de propagación o reproductor de una planta.

25. Un procedimiento para tratar y/o prevenir la infestación por plagas sobre un sustrato que comprende aplicar una cantidad eficaz de un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22 a dicho sustrato.

26. Un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en el control del crecimiento de plagas sobre una célula vegetal o planta o para prevenir la infestación por plagas de una célula vegetal o planta susceptible a infección por dicha especie de plagas, en el que dicho uso comprende poner en contacto dicha especie de plaga con cualquiera de los ARN bicatenario, de modo que el ARN bicatenario sea captado por la especie de la plaga y, de este modo, controla el crecimiento de la plaga o previene la infestación.

27. Un ARN bicatenario para usar de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho ARN bicatenario se expresa por una célula eucariota o procariota, célula huésped no humana u organismo huésped no humano.

28. Un ARN bicatenario para usar de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho ARN bicatenario se expresa por una célulavegetal o planta infestada co o susceptible a la infestación por dicha especie de plaga.

29. Un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en la regulación por disminución de la expresión de al menos un gen diana en una especie de plagas, en el que dicho uso comprende poner en contacto dicha especie de plaga con dicho ARN bicatenario, de modo que el ARN bicatenario sea captado por la especie de la plaga y, de este modo, regula por disminución la expresión del gen (es) diana de la plaga.

30. Un ARN bicatenario para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicho ARN bicatenario se expresa por una célula eucariota o procariota, célula huésped no humana u organismo huésped no humano.

31. Un ARN bicatenario para usar de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicho ARN bicatenario se expresa por una célulavegetal o planta infestada co o susceptible a la infestación por dicha especie de plaga.

32. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que dicho ARN bicatenario se expresa a partir de al menos un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

33. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que dicho ARN bicatenario se expresa a partir de dos constructos de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

34. Un procedimiento para producir una planta resistente a una plaga patogénica, que comprende:

a) transformar una célula vegetal con un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14,

b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, siendo, por tanto, dicha planta cultivada transformada resistente a dicha plaga en comparación con una planta no transformada.

35. Un procedimiento para aumentar el rendimiento de la planta que comprende introducr en una planta al menos un ácido nucleico de la reivindicación 10 o un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en un formato de expresión.

36. Uso de un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un ácido nucleico de la reivindicación 10

o un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o una célula de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, o una composición de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22 para tratar la infección o infestación por plagas de las plantas.

37. Un kit que comprende un ARN bicatenario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un ácido nucleico de la

reivindicación 10 o un constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o una célula de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, o una composición de acuerdo con las reivindicaciones 21 o 22 e instrucciones para usar de dicho ARN bicatenario, ácido nucleico, ADN recombinante, célula o composición para tratar infecciones por plagas de plantas.

38. Un ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en la silenciación de un gen diana en un organismo diana, en el que la secuencia diana se escoge del genoma de un organismo diana, en el que el organismo diana es diferente del organismo en el que el ARNds se expresa y en el que el organismo en el que se expresa el ARNds es una planta o célula vegetal o célula bacteriana o célula fúngica.

39. Un ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en la silenciación de un gen diana en un organismo diana, en el que el gen diana se escoge del genoma de un nematodo, un hongo o un insecto y el organismo en el que se expresa el ARNds es una planta o una célula vegetal.