Un conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a través de un enlace amida,

biendirectamente o bien a través de un resto espaciador que comprende uno o más átomos, a un polímero soluble enagua, en el que el peso molecular promedio en peso del polímero soluble en agua está en el intervalo de 6000daltons a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye más de 6 polímeros solubles en agua unidoscovalentemente al resto de Factor IX y en el que el polímero soluble en agua que es polietilenglicol.

Conjugados de resto de Factor IX y polimeros

Campo de la invención La presente invencion se refiere generalmente a conjugados que comprenden un resto de Factor IX (es decir, un resto que tiene actividad de Factor IX) y a un polimero. Ademas, la presente invencion se refiere a las composiciones que comprenden los conjugados, los metodos para la sintesis de los conjugados, los metodos para el

suministro de los conjugados, y los metodos para el tratamiento de los pacientes.

Antecedentes de la invención

La hemostasis es el proceso de detener el flujo de sangre desde un vaso sanguineo lesionado. Para los mamiferos,

asi como para otros muchos organismos, el proceso hemostatico es de importancia critica para la supervivencia continuada. Los defectos del proceso hemostatico pueden provocar, por ejemplo, la incapacidad de formar de manera eficaz coagulos sanguineos que sirven para detener la perdida de sangre despues de una lesion vascular. En los seres humanos, los individuos que padecen una incapacidad para formar coagulos sanguineos se denominan hemofilicos. Es de particular interes para los hemofilicos el riesgo que amenaza su vida, ya que una vez iniciado, el

sangrado nunca cesara.

Generalmente, los hemofilicos carecen de la capacidad de producir cantidades eficaces de una o mas sustancias que se requieren, en ultima instancia, para la transformacion del fibrinogeno soluble en fibrina. Por ejemplo, los hemofilicos que padecen la hemofilia B (tambien llamada "deficiencia congenita del factor IX" y "enfermedad de

Navidad") tienen la incapacidad de producir niveles eficaces de Factor IX. El factor IX es un componente clave de una de las varias "cascadas" de reacciones que dan como resultado la formacion de coagulos sanguineos. El factor IX, critico para la cascada de reacciones mencionadas como la "via intrinseca", influye en ultima instancia en la conversion del fibrinogeno en el componente principal de los coagulos sanguineos, la fibrina.

Aunque el proceso a traves del cual se forman los coagulos sanguineos es relativamente complejo, el papel del Factor IX en la via intrinseca se puede describir brevemente. Cuando la sangre entra en contacto con superficies con carga negativa y/o tejidos conectivos subendoteliales (como resultado de, por ejemplo, el dano tisular asociado con una laceracion) , el Factor XII (o factor de Hageman) en presencia de otras sustancias se transforma en el Factor Xlla. El factor Xlla (junto con otras sustancias) transforma el Factor XI en el Factor XIa. A su vez, el Factor XIa (junto

con otras sustancias) transforma el Factor IX en el Factor IXa. El Factor VIII, el Factor IXa, los iones de calcio y las micelas fosfolipidicas forman un complejo de lipoproteina con el Factor X y lo activan para formar el Factor Xa. A partir de entonces, el Factor Xa (junto con otras sustancias) convierte la protrombina en trombina, dando como resultado la produccion en el tiempo de una cantidad relativamente grande de trombina. Cantidades relativamente grandes de trombina convierten el fibrinogeno en fibrina. La fibrina, a su vez, forma la matriz o la reticula

responsable de la formacion de los coagulos sanguineos. Se muestra esquematicamente a c ontinuacion el papel del Factor IX en la via intrinseca de la coagulacion sanguinea.

Afectando a uno de cada 34500 hombres, la hemofilia B puede provenir de una diversidad de mutaciones del gen del Factor IX, que se encuentra en el cromosoma X. Dependiendo de la mutacion en particular, la hemofilia B se puede

manifestar en si misma como grave, moderada o leve. Los individuos que padecen las formas mas gravesde hemofilia B carecentotalmente de la capacidad de expresar las formas activas del Factor IX. Clinicamente, los individuos afectados con hemofilia B padecen sangrados nasales, facil aparicion de hematomas, hemorragia en las articulaciones, y sangrado prolongado de lasheridas. El tratamiento actual de la hemofilia Bindica la infusion de concentrado de Factor IX exogeno recogido a partir de plasma humano o preparado a traves de tecnicas de ADN recombinante.Debido a que sus tratamientos solo sirven para complementar la carencia de los niveles eficaces de Factor IX, los individuos que padecen las formas graves de hem ofilia B necesitan inyecciones regulares (tana menudo comotres veces a la semana) deconcentrado de Factor IX alo largo de sus vidas. Los pacientes que padecen incluso las formas mas moderadas de hemofilia B a menudo necesitan la inyeccion de concentrado de Factor IX antes y/o a continuacion de la cirugia y del trabajo dental.

Estan d isponibles varias f ormas comerciales de c oncentrados de Factor I X para pr oporcionar la terapia d e sustitucion para los pacientes que padecen hemofilia B. Por ejemplo, los productos de complejo de Factor IX derivados de la sangre (que contienen otros factores) se comercializan con las marcas BEBULIN VH® (Baxter Healthcare, Viena, Austria) , KONYNE 80® (Bayer Corporation, Elkhart IN) , PROFILNINE SDT (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles CA) , y PROPLEX T® (Baxter Healthcare, Glendale CA) . Las formas algo mas purificadas de productos del Factor IX se comercializan como las marcas ALPHANINE SD® (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles CA) e IVIONONINE® (Aventis Behring, Kankakee IL) . Con respecto a los concentrados de Factor IX preparados de manera recombinante, actualmente esta disponible un producto con la marca BENEFIX® (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge IVIA) .

Generalmente, la fuente recombinante de concentrado de Factor IX se favorece sobre las fuentes derivadas de la sangre ya que las ultimas implican el riesgo de transmision de virus y/o otras enfermedades. Ademas, a menudo la pureza es mas alta con la fuente recombinante, evitando de ese modo los problemas potenciales que surgen de la administracion de factores de sangre no deseados y de otras proteinas generalmente presentes en fuentes derivadas de la sangre.

A pesar de los beneficios de la administracion de una formulacion basada en recombinante, el procesamiento de los productos basados en recombinantes a menudo necesita la presencia de determinadas proteinastales como la albumina, que puede estar presente en la formulacion final administrada al paciente. Como resultado, los pacientes que reciben tales formulaciones desarrollan reaccionesalergicas a estas proteinas extranas.En cualquier caso, tanto l os productos derivados de l a sa ngre co mo l os basados en r ecombinantes sufren l a d esventaja de l a administracion repetida.

La PEGilacion, o la union de un derivado de poli (etilenglicol) a una proteina, se ha descrito como un medio para reducir la inmunogenicidad asi como un medio para prolongar la vida media in vivo de una proteina. Con respecto al Factor IX, sin embargo, los enfoques previos para la formacion de conjugados proteina-polimero sufrieron diversas deficiencias.

Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de America N° 5.969.040 describe un proceso que comprende la etapa de oxidacion de los dioles vecinales de los restos de hidrato de carbono en la region de activacion del Factor IX para formar aldehidos. Despues de la etapa de oxidacion, el proceso que se ha descrito incluye la etapa de union covalente de uno o mas polimeros no antigenicos [tales como un derivado de poli (etilenglicol) que soporta hidrazina] a los restos oxidados de hidrato de carbono. Sin embargo, un problema con este enfoque, es la complejidad aumentadaatribuida a las etapas adicionales necesarias para obteneruna forma oxidada del Factor IX. Ademas, cualquier oxidante que pueda permanecer despues de la etapa de oxidacion puede degradar el polimero asociado con el conjugado. Finalmente, este enfoque se limita a la conjugacion usando polimeros especificos (es decir, polimeros que contienen hidrazida) yregiones especificas en el Factor IX (es decir, dioles vecinales de los restos hidrato de carbono en la region de activacion del Factor IX) .

La presencia de oxidantes (presentes como resultado del proceso que se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos de America N° 5.969.040, o por otras causas) presenta desafios adicionales con respecto a proporcionar un producto farmaceuticamente aceptable de un polimero conjugado con el Factor IX. Especificamente, la metionina y otros aminoacidos que co ntienen hi droxilo se pued en so meter a una oxidacion n o dese ada en presencia d e oxidantes, introduciendo de ese modo grupos aldehido. Cualquier aldehido residual que no reacciono con el reactivo polimerico sera reactivo... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIoNES

1. Un conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a traves de un enlace amida, bien directamente o bien a traves de un resto espaciador que comprende uno o mas atomos, a un po limero soluble en agua, en el que el peso molecular promedio en peso del polimero soluble en agua esta en elintervalo de 6000 daltons a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye mas de 6 polimeros solubles en agua unidos covalentemente al resto de Factor IX y en el que el polimero soluble en agua que es polietilenglicol.

2. Un conjugado que comprende un resto de F actor IX unido covalentemente mediante un enlace amida, bien directamenteo bien a traves de un resto espaciador quecomprende uno o mas atomos, a un polimero no lineal soluble en agua en el que dicho polimero soluble en agua es polietilenglicol.

3. E l co njugado de l a r eivindicacion 1 o de l a r eivindicacion 2, en el qu e el poli (etilenglicol) esta pr otegido terminalmentecon un resto de proteccion terminal seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.

4. El co njugado de l a r eivindicacion 1 o de l a r eivindicacion 2, en el qu e el poli (etilenglicol) esta pr otegido terminalmente con metoxi.

5. El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons.

6. El conjugado de la reivindicacion 5, en el que el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons.

7. El conjugado de la reivindicacion 1, en el que cada polimero soluble en agua es lineal.

8. El conjugado de la reivindicacion 1, en el que cada polimero soluble en agua es ramificado.

9. El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el resto de Factor IX es Factor IX.

10. El conjugado de la reivindicacion 9, en el que el resto de Factor IX es Factor IXa.

11. El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que e l resto de Factor IX esta derivado recombinantemente.

12. El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el resto de Factor IX es derivado de la sangre.

13. El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que no mas de tres polimeros solubles en agua estan unidos al resto de Factor IX.

14. Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados, en la que al menos el 80% de cada uno de todos los conjugados de la composicion esta compuesto por un resto de Factor IX unido covalentemente a uno, dos, tres o cuatro polimeros solubles en agua, cada polimero soluble en agua en el conjugado tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, el resto de Factor IX esta unido al polimero soluble en agua a traves de un enlace amida directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos y en l a que di cho polimero soluble en agu a se selecciona entre un poli (oxido de alquileno) , poli (vinilpirrolidona) , pol i (alcohol vinilico) , p olioxazolina, p oli (poliol o xietilado) , alcohol poliolefinico, poli (hidroxialquilmetacrilamida, pol i (hidroxialquilmetacrilato) , polisacaridos, pol i (a-hidroxiacido) , pol ifosfazeno, polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) .

15. Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados, en la que al menos el 85% de cada uno de todos los conjugados de la composicion tiene de uno a tres polimeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor IX;en la que cada polimero soluble en agua tiene un peso molecular promedio en peso enel intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, y en la que, para cada conjugado, el resto de Factor IX esta unido a de uno a tres polimeros solubles en agua a traves de un enlace amida directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos y en la que el polimero soluble en agua se selecciona del grupo poli (oxido de alquileno) , p oli (vinilpirrolidona) , pol i (alcohol vi nilico) , p olioxazolina, po li (poliol o xietilado) , alcohol pol iolefinico, poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , polisacaridos, poli (a-hidroxiacido) , polifosfazeno, polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) .

16. Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados del resto de Factor IX monoPEGilado, en la que al menos el 85% de todos los conjugados en la composicion son conjugados del resto de Factor IX monoPEGilado, y en la que cada PEG en el conjugado del resto de Factor IX monoPEGilado tiene unpeso molecular promedioen peso en el intervalo de 6000 daltons a 1000000 daltons y el resto de Factor IX esta unido al PEG a traves de un

enlace amida, directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos.

17. La composicionde la reivindicacion 14º 15, enla que el polimero soluble en agua en cada conjugado se selecciona d el gr upo que c onsiste en un pol i (oxido de al quileno) , p oli (vinilpirrolidona) , p oli (alcohol vi nilico) , polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) .

18. La composicion de la reivindicacion 17, en la que cada polimero soluble en agua es un poli (oxido de alquileno) .

19. La composicion de la reivindicacion 18, en la que cada poli (oxido de alquileno) es un poli (etilenglicol) .

20. La composicion de la reivindicacion 19, en la que el poli (etilenglicol) esta protegido terminalmente con un resto de proteccion terminal seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.

21. La composicion de la reivindicacion 19, en la que el poli (etilenglicol) esta protegido terminalmente con metoxi.

22. La composicion de las reivindicaciones 14, 15 o16, en la que el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso total en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons.

23. La composicion de la reivindicacion 22, en la que el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso total en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons.

24. La composicion de las reivindicaciones 14, 15 o 16, en la que el resto de Factor IX es Factor IX.

25. La composicion de la reivindicacion 24, en la que el resto de Factor IX es Factor IXa.

26. La composicion de la reivindicacion 19, en la que el resto de Factor IX esta derivado recombinantemente.

27. La composicion de la reivindicacion 19, en la que el resto de Factor IX es derivado de la sangre.

28. La composicionde las reivindicaciones 14 o 15, en la que no mas de tres polimeros solubles en agua estan unidos al resto de Factor IX.

29. La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamente libre de albumina.

30. La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamentelibre de proteinas que no tienen actividad de Factor IX.

31. La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamente libre de polimeros solubles en agua no unidos covalentemente.

32. La composicion de la reivindicacion 19, en forma liofilizada.

33. La composicion de la reivindicacion 19, en la forma de un liquido.

34. La co mposicion d e l a r eivindicacion 19, que c omprende a dicionalmente u n excipiente f armaceuticamente aceptable.

35. Un metodo para la elaboracion de un conjugado que comprende el contacto, en condiciones de conjugacion, de un resto de Factor IX conun reactivo polimerico, en el que el conjugado comprende un restode Factor IX unido covalentemente a traves de un enlace amida, directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos, a un polimero soluble en agua con un peso molecular promedio en peso de 6000 a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye mas de 6 polimeros solubles en agua unidos individualmente al resto de Factor IX y en el que dicho polimero soluble en agua es poli (etilenglicol) .

36. El metodo de la reivindicacion 35, en la que no se anade alcohol adicional.

37. El metodo de la reivindicacion 35, en la que no se lleva a cabo una etapa de oxidacion.

38. La composicion de la reivindicacion 34 para su uso en un paciente que padece hemofilia B.

39. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 38 para la administracion a un paciente dentro de los dos dias anteriores a someterse a cirugia.