Compuestos antisentido.

Un oligonucleótido antisentido gapmer de 10 a 25 nucleósidos de longitud que comprende una región ala 5' situada en el extremo 5' de un hueco de desoxinucleótidos y una región ala 3' situada en el extremo 3' del hueco de desoxinucleótidos,

en el que al menos un nucleósido de al menos una de las regiones ala es un nucleósido LNA (un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2') y al menos uno de los nucleósidos del ala restantes es un nucleósido 2' modificado no bicíclico.

Compuestos antisentido Antecedentes La dirección a secuencias génicas que provocan enfermedad se sugirió por primera vez hace casi 40 años (Belikova y col., Tet. Lett., 1967, 37, 3557-3562) , y se demostró actividad antisentido en cultivo celular una década después (Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, 75, 280-284) . Una ventaja de la tecnología antisentido en el tratamiento de una enfermedad o afección que proviene de un gen que provoca enfermedad es que se trata de un enfoque genético directo que tiene la capacidad de modular la expresión de genes que provocan enfermedad específicos. Otra ventaja es que la validación de una diana usando compuestos antisentido da como resultado descubrimiento directo e inmediato del agente terapéutico.

En general, el principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido hibrida con un ácido nucleico diana y efectúa modulación de la actividad o función de la expresión génica, tal como transcripción, traducción o corte y empalme. La modulación de la expresión génica puede conseguirse mediante, por ejemplo, degradación de diana o inhibición basada en ocupación. Un ejemplo de modulación de función diana de ARN por degradación es degradación basada en RNasa H del ARN diana tras hibridación con un compuesto antisentido de tipo ADN. Otro ejemplo de modulación de la expresión génica por degradación de diana es ARN de interferencia (ARNi) . ARNi es una forma de silenciamiento génico mediada por antisentido que implica la introducción de ARNbc que conduce a la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm endógenos diana. Esta especificidad de secuencia hace a los compuestos antisentido extremadamente atractivos como herramientas para validación de diana y funcionalización génica, así como agentes terapéuticos para modular de forma selectiva la expresión de genes implicados en la patogénesis de una cualquiera de una diversidad de enfermedades.

La tecnología antisentido es un medio eficaz para reducir la expresión de uno o más productos génicos específicos y puede por lo tanto demostrar ser excepcionalmente útil en varias aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Se usan de forma rutinaria nucleósidos químicamente modificados para su incorporación en compuestos antisentido para potenciar una o más propiedades, tales como resistencia a nucleasa, farmacocinética o afinidad por un ARN diana.

A pesar de la expansión del conocimiento desde el descubrimiento de la tecnología antisentido, sigue habiendo una necesidad no satisfecha de compuestos antisentido con mayor eficacia, toxicidad reducida y menor coste. El resto de ácido nucleico bicíclico (BNA) metilenoxi (4'-CH2-O-2') de alta afinidad, también conocido como resto de “Ícido Nucleico Bloqueado” (LNA) , se ha usado para crear potentes oligonucleótidos antisentido gapmer. Se ha mostrado, sin embargo, que esta potencia está acompañada de un riesgo aumentado de hepatotoxicidad como se indica por la elevación de transaminasas del hígado en experimentos de roedores. Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento compuestos antisentido gapmer para inhibición de ARN diana in vivo que comprenden modificaciones de nucleótidos bicíclicos de alta afinidad, pero que se diseñan para tener toxicidad mitigada por la incorporación de nucleótidos modificados de alta afinidad no bicíclicos. Tales compuestos antisentido gapmer son más eficaces que los compuestos antisentido BNA o LNA previamente descritos, como resultado de una reducción de la toxicidad.

Fluiter y col. (ChemBioChem 2005, 6, 1104-1109) desvela monómeros de ácido nucleico bloqueado y diversos oligonucleótidos que incluyen tales monómeros en gapmer simétricos.

Sumario La presente invención proporciona nuevos oligonucleótidos como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Se desvelan en el presente documento oligonucleótidos antisentido gapmer que muestran mejoras notables en seguridad en comparación con un gapmer de la misma longitud y configuración de ala-hueco-ala, en la que cada nucleótido ala es un ácido nucleótido bicíclico (BNA) , por ejemplo un metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, en ocasiones también denominado LNA. Los oligonucleótidos antisentido gapmer de la presente invención comprenden una región de hueco desoxi, una región ala 5' situada en el extremo 5' del hueco desoxi y una región ala 3' situada en el extremo 3' del hueco desoxi, siendo al menos un nucleótido de al menos una de las regiones ala LNA y siendo al menos uno de los nucleósidos ala restantes un nucleótido modificado 2' no bicíclico. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido gapmer tienen al menos un nucleótido LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) o etilenoxi (4'-CH2-CH2-O-2') BNA en al menos una de las alas y al menos nucleótido modificado de alta afinidad no bicíclico. Los nucleósidos 2' modificados no bicíclicos pueden sustituirse en la posición 2' con –O-alquilo sustituido o no sustituido o –O- (2-acetilamida) sustituido o no sustituido. Por ejemplo, los nucleósidos modificados 2' no bicíclicos podrían ser 2'-OCH3, 2'-O (CH2) 2OCH3 o 2'-OCH2C (O) -NR1R2, en la que R1 y R2 son de forma independiente hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido o, en la alternativa, se toman juntos para realizar un resto heterocíclico.

Además, se desvelan en el presente documento oligonucleótidos antisentido gapmer que tienen un hueco desoxi, una región ala 5' situada en el extremo 5' del hueco desoxi y una región ala 3' situada en el extremo 3' del hueco desoxi, teniendo la región ala 5' al menos un nucleótido modificado de alta afinidad no bicíclico y teniendo la región ala 3' al menos un nucleótido bicíclico 4' a 2', por ejemplo un nucleótido LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) o un etilenoxi (4'-CH2-CH2-O-2') BNA. En un aspecto ejemplar de la divulgación los nucleótidos modificados de alta afinidad no bicíclicos son nucleósidos modificados 2' no bicíclicos. En una realización adicional de la presente invención son oligonucleótidos antisentido gapmer, en los que los nucleósidos modificados 2' no bicíclicos se sustituyen en la posición 2', por ejemplo, 2'-OCH3, 2'-O (CH2) 2OCH3 o 2'-OCH2C (O) -NR1R2, en las que R1 y R2 son de forma independiente hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido o, en la alternativa, se toman juntos para hacer un resto heterocíclico.

En una cierta realización, los oligonucleótidos antisentido gapmer no tienen BNA en la región ala 5', por ejemplo, no tienen nucleósidos LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) o etilenoxi (4'-CH2-CH2-O-2') BNA. En una realización adicional, los oligonucleótidos antisentido gapmer desvelados en el presente documento tienen una región ala 5' que tiene solamente nucleótidos modificados 2'-O (CH2) 2OCH3 y solamente nucleósidos LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) en el ala 3'.

En otra realización más, los oligonucleótidos antisentido gapmer en los que la región 5' tiene al menos un nucleótido bicíclico 4' a 2' y la región ala 3' tiene al menos un nucleótido modificado 2' no bicíclico. En una cierta realización, los oligonucleótidos antisentido gapmer no tienen nucleótidos LNA en la región ala 3', por ejemplo no tienen nucleótidos LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) o etilenoxi (4'-CH2-CH2-O-2') BNA. En una realización adicional, los oligonucleótidos antisentido gapmer desvelados en el presente documento tienen una región ala 5' que tiene solamente nucleótidos LNA (metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA) y una región ala 3' que tiene solamente nucleósidos modificados 2', por ejemplo, los nucleósidos modificados 2' no bicíclicos pueden sustituirse en la posición 2' con –Oalquilo sustituido o no sustituido o –O- (2-acetilamida) sustituido o no sustituido. Por ejemplo, los nucleósidos modificados 2' no bicíclicos podrían ser 2'-OCH3, 2'-O (CH2) 2OCH3 o 2'-OCH2C (O) -NR1R2, en los que R1 y R2 son de forma independiente hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido o, en la alternativa, se toman juntos para hacer un resto heterocíclico.

Los oligonucleótidos antisentido gapmer de la presente invención pueden ser shortmer u oligonucleótidos antisentido de hueco ensanchado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido gapmer son de 10 a 25, 10 a 14, 12 a 25, 15 a 25 ó 18 a 24 nucleótidos de longitud. La regiones 5' y 3' de los compuestos antisentido de la presente invención son independientemente de entre 1 y 7 nucleótidos de longitud, o de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 nucleótidos de longitud; entre 1 y 5 nucleótidos de longitud, o 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos de longitud; o entre 1 y 3 nucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido gapmer de 10 a 25 nucleósidos de longitud que comprende una región ala 5' situada en el extremo 5' de un hueco de desoxinucleótidos y una región ala 3' situada en el extremo 3' del hueco de desoxinucleótidos, en el que al menos un nucleósido de al menos una de las regiones ala es un nucleósido LNA (un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2') y al menos uno de los nucleósidos del ala restantes es un nucleósido 2' modificado no bicíclico.

2. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que el nucleósido 2' modificado no bicíclico se sustituye en la posición 2' con un –O-alquilo sustituido o no sustituido o -O- (2-acetilamida) sustituida o no sustituida, en el que el nucleósido 2' modificado no bicíclico comprende un 2'-OCH3, 2'-O (CH2) 2OCH3, o 2'-OCH2C (O) -NR1R2, en el que R1 y R2 son de forma independiente hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido o, como alternativa, se toman juntos para hacer un resto heterocíclico.

3. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que el nucleósido 2' modificado no bicíclico se sustituye en la posición 2' con un –O-alquilo sustituido o no sustituido.

4. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que el nucleósido 2' modificado no bicíclico es un nucleósido 2'-O-metoxietilo.

5. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que las regiones ala son de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 7 nucleósidos de longitud.

6. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que la región hueco desoxi es de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 18 nucleósidos de longitud.

7. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que el ala 3' comprende al menos un nucleósido LNA.

8. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 7, en el que el ala 5' comprende al menos un nucleósido 2' modificado no bicíclico.

9. El oligonucleótido antisentido gapmer de la reivindicación 1, en el que el ala 5' tiene al menos un nucleósido LNA.

10. El oligonucleótido antisentido gapmer de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que tiene al menos un engarce internucleosídico modificado, en el que el engarce internucleosídico modificado es un fosforotioato, teniendo el oligonucleótido antisentido gapmer una pluralidad de engarces internucleosídicos fosforotioato.

11. Un oligonucleótido antisentido gapmer de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en un procedimiento para reducir la expresión de un ARN diana en un animal, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho animal dicho oligonucleótido antisentido gapmer, siendo la secuencia de dicho oligonucleótido antisentido complementaria de dicho ARN diana.