Un péptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos:

Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys en la que:

Xaa es piroglutamato, R 1 = Phe o Trp o Tyr o Leu o Thr, R2 = Pro o Arg, R3 = Glx o Asx o Gly, R4 = Asn o Gln o Leu, R5 = Glx o Asx, y R6 = Glx o Lys, en la que los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14 están ligados por un puente disulfuro intramolecular (SEQ ID NO: 4); una sal o un solvato del mismo.

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a compuestos que inducen analgesia o que actúan sobre los receptores de opioides en mamíferos. Más específicamente, la presente invención se refiere a compuestos análogos de péptidos con efecto analgésico derivados del veneno de la serpiente Crotalus durissus terrificus, a sus usos, composiciones farmacéuticas y a procedimientos de preparación y purificación.

Antecedentes de la invención:

Según los datos de la Sociedade Brasileira para o Estudo da Dor [Sociedad Brasileña para el Estudio del Dolor] (SBED, 2004 http://www.dor.org.br/dor_impactos.asp) , el dolor afecta al menos al 30% de los individuos en algún momento de sus vidas, y del 10% al 40% de estos individuos, el dolor dura más de un día. El dolor es la principal causa de sufrimiento, incapacidad laboral y provoca graves consecuencias psicosociales y económicas. Aproximadamente el 40% de estos individuos pierden muchos días de trabajo. No hay estadísticas oficiales sobre el impacto de las afecciones del dolor en la población brasileña, pero su incidencia ha aumentado sustancialmente en los últimos años. Además, la incidencia del dolor crónico en el mundo oscila del 7% al 40% de la población. Como consecuencia, del 50% al 60% de aquellos individuos que padecen dolor crónico llegan a incapacitarse parcialmente o totalmente, temporalmente o permanentemente, comprometiendo significativamente la calidad de vida.

El uso terapéutico de venenos de serpiente observado en seres humanos se remonta a principios del siglo XX (Brasil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950; Klobusitzky D. Anais do Instituto Pinheiros, 1:3-23, 1938) y la bibliografía presenta importantes revisiones del uso de estos venenos como agentes terapéuticos. Estas revisiones muestran, por ejemplo, el uso del veneno de Crotalus adamanteus para el tratamiento de la epilepsia y el uso del veneno de Agkistrodon piscivorus, Vipera russelli y Notechis scutatus como agentes hemostáticos (Klobusitzky, D. Anais do Instituto Pinheiros, 1:3-23, 1938) .

Los informes sobre la propiedad analgésica de venenos de serpiente observada en seres humanos se remonta a principios de la década de los 30 (Monaelesser & Taguet, 1933, apud on Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398-408, 1950) . Con respecto al efecto analgésico del veneno de la serpiente de cascabel sudamericana (Crotalus durissus terrificus) , denominado en lo sucesivo "CdtV", los primeros estudios se realizaron por el Dr. Vital Brazil. En estos estudios, el Dr. Vital Brazil preparó disoluciones de veneno crotálido altamente diluidas denominadas soluto crotálido. La disolución crotálida se distribuyó a varios médicos en Brasil y en el extranjero y se usó para el tratamiento de diferentes afecciones y trastornos de dolor, principalmente de origen neoplásico. Los resultados de este estudio demostraron que el veneno de la serpiente de cascabel es altamente eficaz en el tratamiento de diferentes síndromes de dolor (Brazil, V. Biol. Med. São Paulo, 1: 7-21, 1934, Brazil, V. An. Paul. Med. Cir., 60: 398408, 1950) .

Con respecto al uso de productos derivados de veneno de serpiente para el tratamiento de afecciones dolorosas, cabe destacar el desarrollo de un producto llamado anaveneno, producido en el Instituto Butantan, por la mezcla de estos venenos con formaldehido que es altamente relevante. Estos productos se indicaron para el tratamiento de diferentes afecciones dolorosas, particularmente en casos en los que los analgésicos usuales no tenían efecto. Este producto demostró potente efecto analgésico, ya que este producto podía sustituir el tratamiento con morfina. El anaveneno también demostró efecto analgésico a largo plazo, ya que los pacientes se trataron normalmente con anaveneno a intervalos de 1 a 3 días entre dosis.

A pesar de los resultados observados por el Dr. Vital Brazil, que muestran el efecto analgésico del veneno de la serpiente Crotalus durissus terrificus, no se supo la sustancia activa presente en el veneno bruto responsable del efecto analgésico.

Los estudios de los mecanismos de la acción analgésica de este veneno usando modelos experimentales de evaluación del dolor empezaron en 1990.

Estos estudios mostraron que el CdtV, administrado en ratones, induce un efecto antinociceptivo de larga duración cuando se evalúa en la prueba de la placa caliente, sugiriendo que este veneno puede causar analgesia mediante una acción en el sistema nervioso central (Giorgi R. y col., Toxicon, 31: 1257-65, 1993; Picolo G. y col. Toxicon 36:223-227, 1998) . Los estudios farmacológicos mostraron la participación de receptores de opioides kappa (Giorgi R. y col., Toxicon, 31: 1257-65, 1993; Brigatte P. y col. Toxicon 39:1399-1410, 2001) en la antinocicepción observada en la prueba de la placa caliente. Tratamientos largos usando el veneno indujeron tolerancia al efecto antinociceptivo en la prueba de la placa caliente, pero no dependencia física. La tolerancia está mediada por mecanismos farmacodinámicos. No se observó tolerancia cruzada con morfina (Brigatte P. y col. Toxicon 39:13991410, 2001) . Por otra parte, debido al efecto antinociceptivo de larga duración del veneno (5 días después de la administración de una dosis única) , no hay desarrollo del fenómeno de tolerancia si el veneno se administra cada 5 días, durante hasta 65 días después de empezar el tratamiento (Brigatte P. y col. Toxicon 39:1399-1410, 2001) .

Además del efecto observado en la prueba de la placa caliente, la acción analgésica se demostró para el veneno bruto en dos modelos experimentales de dolor inflamatorio: el modelo de las contorsiones abdominales

inducidas por ácido acético (Giorgi R. y col., Toxicon, 31: 1257-65, 1993) y en hiperalgesia inducida por carragenina (Picolo G. y col., Eur J Pharmacol 391:55-62, 2000) . En el modelo de carragenina, el efecto analgésico del veneno también es un efecto de larga duración, persistiendo hasta 5 días después de la administración de una dosis única del veneno. Este efecto implica la participación de receptores de opioides delta periféricos (Picolo G. y col., Eur J Pharmacol 391:55-62, 2000) .

Por otra parte, en el modelo de hiperalgesia inducida por prostaglandina, la acción antinociceptiva del veneno crotálido está mediada por receptores de opioides kappa y delta (Picolo G. y col. Eur J Pharmacol 469:5764, 2003) . En ambos modelos de hiperalgesia (carragenina y prostaglandina) , la antinocicepción inducida por CdtV también implica la estimulación de la ruta de la L-arginina / óxido nítrico (NO) / cGMP, de la proteína cinasa dependiente de cGMP y la activación de canales de potasio sensibles a ATP (Picolo G. y col. Eur J Pharmacol 469:57-64, 2003, Picolo y Cur y , Life Science 75:559-73, 2004) .

Es importante enfatizar que el veneno también puede inducir antinocicepción en modelos de dolor persistente, como en el modelo de dolor neuropático inducido por constricción crónica del nervio ciático de ratas (Gutierrez, V. P., Chacur, M., Sampaio, S.C., Picolo, G., Cur y , Y. Memórias do Instituto Butantan vol. 60, pág. 50, 2003) y en el modelo de dolor por cáncer inducido por la inyección intraplantar de células del carcinoma Walker 256 en ratas (Brigatte, P., Sampaio S.C., Gutierrez, V., Curi, R. Rangel-Santos, A.C:, Guerra, J.L., Cur y Y., XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Programa e Resumos, pág. 195, 2004) . El efecto del veneno en el modelo de dolor neuropático también es largo, ya que se detectó durante hasta 3 días después de la administración de una dosis única del veneno. Como se ha observado en los modelos de hiperalgesia inducida por carragenina o prostaglandina, los receptores de opioides kappa y delta, la ruta de la L-arginina / NO / cGMP y la apertura de canales de potasio sensibles a ATP son responsables del efecto del veneno en este modelo (Gutierrez, V. P., Chacur, M., Sampaio, S.C., Picolo, G., Cur y , Y. Memórias do Instituto Butantan, vol. 60, pág. 50, 2003) .

Los venenos de serpiente están constituidos por una compleja mezcla de proteínas y péptidos biológicamente activos. De estos venenos ya se aislaron varias sustancias activas con diferentes indicaciones terapéuticas. Como ejemplos, los inventores tienen la patente US5182260 (Maraganore, J.H., 1993) , en la que un inhibidor de polipéptidos de la activación de plaquetas se aisló del veneno de la serpiente Water Moccasin norteamericana, o la patente US5763403 (Lyan, E.C.Y., 1998) , en la que se obtuvo una proteína anticoagulante... [Seguir leyendo]

1. Un péptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys en la que:

Xaa es piroglutamato, R 1 = Phe o Trp o Tyr o Leu o Thr, R2 = Pro o Arg, R3 = Glx o Asx o Gly, R4 = Asn o Gln o Leu, R5 = Glx o Asx, y R6 = Glx o Lys, en la que los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14 están ligados por un puente disulfuro intramolecular (SEQ ID NO: 4) ; una sal o un solvato del mismo.

2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys en la que los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14 están ligados por un puente disulfuro intramolecular (SEQ ID NO: 2) .

3. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Phe-Cys en la que los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14 están ligados por un puente disulfuro intramolecular (SEQ ID NO: 3) .

4. El péptido de la reivindicación 1, en el que R2 es Pro.

5. El péptido de la reivindicación 4, en el que Pro está hidroxilado.

6. El péptido de la reivindicación 1, en el que R3 es Glu.

7. El péptido de la reivindicación 1, en el que R5 es Glu.

8. El péptido de la reivindicación 6 ó 7, en el que Glu está y-carboxilado.

9. El péptido de la reivindicación 1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys

en la que:

Xaa es piroglutamato R1 = Phe o Trp o Tyr o Leu o Thr, R2 = Pro o Arg, R3 = Glx o Asx o Gly, R4 = Asn o Gln o Leu, R5 = Glx o Asx, y R6 = Glx o Lys, en la que los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14 están ligados por un puente disulfuro intramolecular; o una sal o a solvato del mismo (SEQ ID NO: 4)

10. El péptido de la reivindicación 9, en el que R2 es Pro.

11. Los péptidos de la reivindicación 10, en el que Pro está hidroxilado.

12. El péptido de la reivindicación 9, en el que R3 es Glu.

13. El péptido de la reivindicación 9, en el que R5 es Glu.

14. El péptido de la reivindicación 12 ó 13, en el que Glu está y-carboxilado.

15. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido puede causar analgesia en un sujeto.

16. Una composición farmacéutica que comprende uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y uno o más péptidos que comprenden la secuencia SEQ ID NO: 4.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que dichos péptidos comprenden la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la composición está en forma de una disolución, una suspensión, una pasta, una cápsula, un gel, un comprimido, una píldora, un polvo, un gránulo, una sustancia liofilizada, un sistema de liberación controlada, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, un liposoma, o la composición comprende un recubrimiento orgánico.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la composición comprende un diluyente basado en agua.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la composición se formula para uso oral, intramuscular, intravenoso, subcutáneo, tópico, pulmonar, intranasal, bucal, rectal, sublingual, intradérmico, intraperitoneal o intratecal.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que la composición se formula para uso oral.

22. El péptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 para su uso en el tratamiento, diagnóstico o prevención de una afección modulada por receptores de opioides.

23. El péptido para su uso según la reivindicación 22, en el que dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

24. El péptido para su uso según la reivindicación 22, en el que el péptido es un agonista de receptores de opioides directo o indirecto.

25. El péptido para su uso según la reivindicación 22, en el que el péptido es un antagonista de receptores de opioides directo o indirecto.

26. El péptido para su uso según la reivindicación 22, en el que la afección se modula por receptores de opioides de tipo kappa.

27. El péptido para su uso según la reivindicación 22, en el que el péptido se usa en la preparación de una composición farmacéutica analgésica.

28. El péptido para su uso según la reivindicación 27, en el que la composición tiene un efecto analgésico de larga duración.

29. El péptido para su uso según la reivindicación 28, en el que el efecto analgésico dura hasta 5 días.

30. El péptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 para su uso en el tratamiento, diagnóstico o prevención de dolor.

31. El péptido para su uso según la reivindicación 30, en el que dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

32. El péptido para su uso según la reivindicación 30, en el que el dolor es agudo o crónico.

33. El péptido para su uso según la reivindicación 30, en el que el dolor se selecciona del grupo que consiste en: dolor relacionado con cáncer, dolor neuropático, dolores asociados a neoplasia, fibromialgia, dolor dental, dolor por dismenorrea, renal, dolor menstrual, dolor por cólico biliar, dolor de articulaciones, artritis, hipertensión intraocular, dolor postartroscopia, dolor ginecológico postlaparoscopia, dolor producido por nefrolitotomía percutánea, dolor postprostatectomia retropúbica radical, dolor post-toracotomía, dolor post-tonsilectomía en pacientes pediátricos, dolor posthisterectomía, dolores postoperatorios por cesárea y dolor asociados a: quemaduras, dependencia de cocaína, dependencia de opioides, proliferación celular, carcinoma pulmonar de células pequeñas, depresión, psicosis, inflamación, afecciones asociadas a un aumento de angiogénesis, heridas, enfermedad isquémica coronaria, enfermedad de Parkinson, disquinesia, encefalopatía hepática, enfermedad cognitiva, enfermedad de Alzheimer, picor debido a colestasis hepática e hiperinsulinemia.

34. El péptido para su uso según la reivindicación 33, en el que el dolor es dolor neuropático seleccionado del grupo que consiste en neuralgia trigeminal, distrofia simpática, neuralgia postherpética, dolor de miembro fantasma, accidente postcerebrovascular y neuropatía diabética.

35. El péptido para su uso según la reivindicación 33, en el que la artritis es artritis reumatoide o artritis degenerativa.

36. Un procedimiento para producir el péptido de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende oxidar grupos sulfhidrilo sobre los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 14, formando así un puente disulfuro intramolecular entre los residuos de cisteína.

37. El procedimiento de la reivindicación 36 que comprende el uso de yodo como un agente de oxidación.

38. El procedimiento de la reivindicación 36 que comprende síntesis de péptidos en fase sólida.

39. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que dicho péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

40. El procedimiento de la reivindicación 38, que comprende el uso de la resina H-Cys (Trt) -2-ClTrt como soporte sólido.

41. Un procedimiento para producir el péptido de la reivindicación 1 que comprende purificar una mezcla de compuestos de origen sintético o semisintético.

42. Un procedimiento para producir el péptido de la reivindicación 1 que comprende purificar una mezcla de compuestos de origen biológico.

43. El procedimiento de la reivindicación 42, en el que la mezcla consiste en veneno sin refinar de una serpiente Crotalus durissus terrificus.

44. El procedimiento de la reivindicación 42, en el que la mezcla se obtiene de un cultivo celular o de un microorganismo recombinante.

45. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44 que comprende precipitación selectiva de péptidos.

46. El procedimiento de la reivindicación 45 que comprende el uso de una disolución de ácido trifluoroacético en acetonitrilo y agua como agente para la precipitación selectiva.

47. El procedimiento de la reivindicación 46 que comprende la aplicación de una disolución de aproximadamente el 0, 1% de ácido trifluoroacético en una mezcla de aproximadamente 1 parte de acetonitrilo con respecto a 2 partes de agua.

48. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44 que comprende cromatografía.

49. El procedimiento de la reivindicación 48 que comprende el uso de columnas de HPLC de fase inversa.

50. El procedimiento de la reivindicación 48 que comprende el uso de fase móvil con concentración en gradiente.

51. El procedimiento de la reivindicación 50 que comprende el uso de una disolución de ácido trifluoroacético en una mezcla de agua y acetonitrilo como fase móvil.

52. Un procedimiento para identificar compuestos que imitan la actividad analgésica de un péptido que consiste en SEQ ID NO: 1, procedimiento que comprende

a) evaluar la actividad biológica de un péptido que consiste en SEQ ID NO: 1 para determinar la actividad de analgesia del péptido, b) evaluar la actividad biológica de un compuesto de prueba para determinar la actividad de analgesia del compuesto de prueba; y c) comparar los resultados obtenidos para la actividad biológica del péptido con los resultados obtenidos para la actividad biológica del compuesto de prueba.

53. Un procedimiento para identificar compuestos que imitan la actividad analgésica de un péptido que consiste en SEQ ID NO: 1, procedimiento que comprende:

a) poner en contacto un péptido marcado que consiste en SEQ ID NO: 1 con una muestra, b) añadir un compuesto de prueba a la muestra en contacto con el péptido marcado; y c) medir la unión del péptido marcado con la muestra.

DOCUMENTOS INDICADOS EN LA DESCRIPCIÓN

En la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.

Documentos de patente indicados en la descripción

Literatura de patentes no citadas en la descripción