La presente invención pertenece al campo de las composiciones químicas utilizadas en métodos de determinación de actividad enzimática.

En particular, la presente invención se encuadra en los métodos cinéticos de determinación de la actividad lipasa que utilizan sustratos sintéticos.

Composición y método cinético de medición de la actividad lipasa.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de las composiciones químicas utilizadas en métodos de determinación de actividad enzimática. En particular, la presente invención se encuadra en los métodos cinéticos de determinación de la actividad lipasa que utilizan sustratos sintéticos.

Antecedentes de la invención

Los métodos de medición de actividad lipasa existentes en el campo de la técnica requieren el análisis individual de muestras, con procedimientos de múltiples pasos por lo que son difíciles de automatizar. Los métodos conocidos de medición de la actividad lipasa incluyen métodos de punto final y métodos cinéticos con sustratos sintéticos. En ambos métodos, las mezclas de reacción presentan una elevada turbidez debido a la baja solubilidad de los sustratos sintéticos en soluciones acuosas, lo que limita la utilización de estos métodos en la industria alimentaria, química o farmacéutica.

Para posibilitar la cuantificación de la actividad lipasa mediante técnicas espectrofotométricas en el rango visible, los métodos de punto final requieren un paso último de extracción de la solución cromófora. Los métodos cinéticos, en cambio, no han podido adaptarse a técnicas colorimétricas. Las alternativas que existen en el campo de la técnica comprenden el pH Stat (velocidad de consumo de hidróxido para mantener el pH) o pH Shift o pH drop (caída de pH), que tienen el inconveniente de requerir el análisis individual de cada réplica de cada muestra. En 2003 He et al., idearon un método cinético de medición de la actividad esterasa mediante absorbancia de 1-naftol en el rango de luz ultravioleta (He et al., 2003. Arch Insect Biochem Physiol. 54:68-76). Sin embargo, el 1-naftol no es un sustrato específico para lipasas, sino uno general para esterasas, y la medición en UV requiere contenedores especiales como por ejemplo cubetas de cuarzo lo que dificulta la monitorización simultanea de múltiples pruebas.

McKellar et al., diseñaron en 1986 un método de punto final que incluye un ensayo colorimétrico altamente específico para lipasas, pues el sustrato sintético utilizado, el β-naftil caprilato (BNC), presenta un enlace ester entre el ácido caprílico y el β-naftol (BN) que es insensible a la acción de esterasas que no sean lipasas. Sin embargo, este ensayo presenta la desventaja de que las muestras deben centrifugarse para poder medir la actividad por lo que no es posible obtener una medida total de la actividad lipasa en una muestra dada. En 1989, Versaw et al., idearon una mejora de dicho método que presenta más sensibilidad y no requiere la centrifugación de las muestras, por lo que permite la medida de la actividad lipasa total de una muestra. Dicha mejora consiste en la extracción y solubilización del cromóforo (formado por la reacción de Fast Blue BB (FBBB) con el β-naftol liberado en la reacción enzimática del BNC) con un solvente orgánico compuesto por etanol y etil acetato. La adición de dicho solvente produce una mezcla clara, apta para estudios de absorbancia en el visible. Sin embargo, esta medición no es posible de manera cinética debido a que la naturaleza hidrofóbica del sustrato provoca la turbidez de la muestra y hace imprescindible la extracción del cromóforo.

Las lipasas actúan en la interfase grasa-agua por lo cual algunos inventores han intentado generar una emulsión de reactivos mediante la utilización de surfactantes con el objeto de aumentar la superficie de sustrato expuesta a la enzima. Los detergentes no-iónicos han demostrado ser capaces de optimizar la actividad enzimática de lipasas procariotas y eucariotas a concentraciones cercanas a su concentración micelar crítica (CMC) gracias a su habilidad de aumentar la superficie de sustrato expuesta al enzima. Por ejemplo, la utilización de detergentes no-iónicos derivados del polioxietileno, como el Tween 20, consigue máxima actividad enzimática de lipasas procarióticas a concentraciones de entre 0,03-0,25% de la mezcla de reacción. En fuerte contraste, los detergentes aniónicos como los alquil-benceno sulfonatos y los alquil sulfatos han demostrado ser potentes inhibidores de la actividad lipasa incluso a pequeñas concentraciones (Helistö et al., 1998 Enzyme and microbial Technology 23:113-117), por lo que se utilizan en los métodos de punto final previamente a la extracción del cromóforo para detener la reacción (Bardi et al., 1993. J. Inst. Brew. 99: 385-388; He et al., 2003. Arch Insect Biochem Physiol. 54:68-76).

La acción inhibitoria sobre la actividad lipasa de los detergentes aniónicos de debe a su habilidad de producir la desnaturalización del enzima por desestabilización de sus estructuras terciaria y/o cuaternaria. En efecto, esta es la base de la utilización del dodecil sulfato sódico (SDS) para separación de proteínas en las electroforesis en gel de acrilamida (PAGE), debido al poder desnaturalizador de los alquil benceno sulfonatos lineares (LAS) y los aquil sulfatos, como el sodio dodecil sulfato (SDS) considerado el más potente de su clase de detergentes (Anionic surfactants Analytical Chemistry. Surfactant science series. Vol 43. 1992. Marcel Dekker, Inc.). LAS es inhibidor de lipasas procariotas y eucariotas a concentraciones cercanas e inferiores a su CMC (130 μM) (Helistö et al., 1998 Enzyme and microbial Technology 23:113-117). Las hbox{mismas propiedades se atribuyen en el campo de la técnica al SDS cuya CMC es 8,5 mM a 25ºC.}

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que añadiendo un detergente aniónico a la mezcla de reacción a una concentración por encima de su CMC, en un método cinético para la medición de actividad lipasa, se obtiene una solución clara, apta para técnicas de espectrofotometría en el visible, que no afecta significativamente la actividad enzimática ni provoca una desnaturalización del enzima en el tiempo de reacción establecido y que puede, por tanto, utilizarse en el análisis cinético de la actividad lipasa. Además, los inventores de la presente solicitud han ideado un método de detección o medición de la actividad lipasa que permite la cuantificación simultanea de múltiples muestras de diferente origen en volúmenes micrométricos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Cinética de actividad lipasa a diferentes concentración del detergente aniónico. La concentración final del substrato BNC y del reactivo cromogénico en la mezcla de reacción final fue de 1 mM. La actividad lipasa se mide como incremento de absorbancia a 550 nm por unidad de tiempo. La actividad lipasa se ve favorecida a concentraciones finales del detergente aniónico superiores a 0,2% (6,9 mM) e igual o inferiores a 0,4% (13,5 mM). En el eje de las ordenadas se expresa la absorbancia a 550 nm y en el eje de las abscisas el tiempo de reacción en minutos. El recuadro superior izquierdo indica concentración final de SDS en % y el recuadro superior derecho la concentración final mM de SDS en los tratamientos.

Figura 2: Cinética de actividad lipasa a diferentes concentraciones del reactivo BNC. La concentración final del reactivo cromogénico en la mezcla de reacción final fue de 1 mM y del detergente aniónico fue de 0,4% (13,5 mM). La actividad lipasa se mide como incremento de absorbancia a 550 nm por unidad de tiempo. La actividad lipasa se ve favorecida a concentraciones finales de 1 mM del substrato BNC. En el eje de las ordenadas se expresa la absorbancia a 550 nm y en el eje de las abscisas el tiempo de reacción en minutos. El recuadro superior izquierdo indica concentración final de BNC (mM) en los tratamientos.

Figura 3 Cinética de actividad lipasa a diferentes concentraciones del reactivo cromogénico. La concentración final del sustrato BNC en la mezcla de reacción final fue de 1 mM y del detergente aniónico fue de 0,4% (13,5 mM). La actividad lipasa se mide como incremento de absorbancia a 550 nm por unidad de tiempo. La actividad lipasa se ve favorecida a concentraciones finales de 1 mM del reactivo cromogénico. En el eje de las ordenadas se expresa la absorbancia a 550 nm y en el eje de las abscisas el tiempo de reacción en minutos. El recuadro superior izquierdo indica concentración final del reactivo cromogénico (mM) en los tratamientos.

Figura 4 Concentración óptima del detergente aniónico, en la mezcla de reacción final, para la actividad lipasa. La actividad lipasa se expresa como la velocidad de generación de color, por la formación...

1. Composición para la medición cinética (MRC) de la actividad lipasa que comprende: