Composición liofilizada que contiene WT-1 y CPG.

Una composición liofilizada que comprende uno o más antígenos no cargados positivamente y un oligonucleótidoinmunoestimulador que contiene CpG,

en la que dicho uno o más antígenos es WT-1, o un derivado o fragmentodel mismo, en la que el derivado es bastante similar a los antígenos nativos para retener propiedades antigénicasy seguir siendo capaz de permitir una respuesta inmune que sea alta contra el WT-1, y en la que el fragmentotiene al menos 8 aminoácidos de longitud y es capaz de inducir una respuesta inmune que presenta una reaccióncruzada con el WT-1 de origen natural.

Composición liofilizada que contiene WT-1 y CPG

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones antigénicas mejoradas y procedimientos de uso de las mismaspara preparar composiciones inmunogénicas. En particular la presente invención se refiere a composiciones liofilizadas que comprenden un antígeno y un agonista del receptor de tipo Toll (TLR) 9. Tales composiciones sepueden reconstituir en composiciones inmunogénicas para uso en vacunación con un vehículo seleccionado entre elgrupo de vehículos particulados que consiste en liposomas, sales minerales, emulsiones, polímeros e ISCOM. Los procedimientos de preparación de composiciones inmunogénicas a partir de composiciones liofilizadas de la invención y uso de las mismas en la inmunización son también parte de la presente invención.

Antecedentes de la invención Los adyuvantes se usan algunas veces para mejorar las respuestas inmunes que surgen a cualquier antígeno dado.Sin embargo la inclusión de adyuvantes en una vacuna o composición inmunogénica incrementa la complejidad depreparación de los componentes así como la complejidad de distribución y formulación de la composición de vacuna.La preparación de cada uno de los componentes de adyuvantes así como el componente antigénico debe ser considerada por los formuladores. Esto es particularmente verdad porque por ejemplo el pH de los componentesadyuvantes en solución puede ser muy diferente del pH óptimo para un antígeno dado y estas diferencias necesitanser controladas y tratadas cuidadosamente para evitar, por ejemplo la precipitación o pérdida de propiedadesdeseables de los componentes. El pH del antígeno en agua para inyección puede, por ejemplo seraproximadamente pH 7 o ligeramente mayor y cuando el adyuvante se añade el pH puede ser tan bajo como pH 6, 3. El antígeno puede, por ejemplo no ser estable cuando se almacena durante períodos prolongados a este pH.

Los componentes se deben, por tanto, formular y distribuir en una forma que sea tan estable como sea posibledebido a que los productos farmacéuticos para uso humano deben estar bien caracterizados, ser estables y segurosantes de que se puedan aprobar para la comercialización. Por esta razón se deben realizar estudios de estabilidad alargo plazo sobre la formulación final para asegurar que cumple los criterios relevantes. La información generada en tales estudios a largo plazo se usa para apoyar la propuesta a las autoridades reguladoras tal como la FDA (Autoridad de Fármacos Federal - el organismo responsable de la aprobación de medicinas en los Estados Unidos) para mostrar que el producto es adecuado para uso en seres humanos.

El secado por congelación o liofilización, se usa en general para incrementar la estabilidad y por lo tanto la vidadurante el almacenamiento del material incluyendo los materiales farmacéuticos tales como un antígeno usado en vacunas.

A menudo se proporcionan las composiciones antigénicas liofilizadas para las profesiones de la asistencia sanitariapara reconstitución con diluyente (por ejemplo agua para inyección [WFI] o en algunos casos una formulación deadyuvante líquida) un poco de tiempo antes de la administración al paciente. De esta forma el período de tiempo quelos diversos componentes de la vacuna final se mantienen en estrecha proximidad se minimiza.

Muchos factores se deben considerar cuando los antígenos se liofilizan para formar tortas liofilizadas (el productoseco de la liofilización) . Por ejemplo, la antigenicidad / inmunogenicidad del antígeno se debe mantener en la formaliofilizada. El antígeno no se debe agregar o degradar mientras esté en la forma liofilizada. La torta liofilizada seformará bien y no se colapsará. Finalmente, el antígeno debe naturalmente estar en una forma que se disuelvarápidamente cuando se reconstituya. Cuando la solución para la reconstitución no es simplemente WFI, por ejemplo cuando el antígeno se reconstituye con adyuvante líquido, entonces necesita considerarse el impacto de los componentes de la solución sobre las propiedades del producto reconstituido.

Como se ha mencionado los adyuvantes se han usado durante muchos años para mejorar la respuesta inmune alcomponente antigénico de una vacuna. Una combinación adyuvante particularmente potente es una que comprendeMonofosforil Lípido A 3-Desacilado (3D-MPL) y una saponina, particularmente QS21, una fracción purificada de saponina extraída de la corteza de Quillaja saponaria Monara. Esta combinación se puede proporcionar, por ejemploen forma de una emulsión de aceite en agua, formulación liposomal o similares.

En los ensayos clínicos previos con antígenos, por ejemplo con los antígenos de malaria tal como RTS, S seproporciona el antígeno liofilizado y también se proporciona un vial separado de adyuvante líquido, por ejemplo unaformulación de aceite en agua de MPL y QS21 o una formulación liposomal de MPL y QS21 para reconstituir el antígeno. Los componentes individuales se combinan para formar la composición de vacuna final un poco antes dela administración.

Ciertos oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen los dinucleótidos CpG no metilados (“CpG”) son ligandos TLR9 y se han identificado por ser adyuvantes cuando se administran mediante las vías tanto sistémica como mucosal (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J.Immunol, 1998, 160 (2) :870-876; McCluskie y Davis, J.Immunol., 1998, 161 (9) :4463-6) . CpG es una abreviatura de motivos del dinucleótido citosina- guanosinapresentes en el ADN. Históricamente, se observó que la fracción de AND de BCG puede ejercer un efectoantitumoral. En estudios posteriores, los oligonucleótidos sintéticos derivados de las secuencias del gen BCG semostró que eran capaces de inducir efectos inmunoestimuladores (tanto in vitro como in vivo) . Los autores de estosestudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo central de CG, llevaban esta actividad. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulación se elucidó más tarde en una publicación deKrieg, Nature 374, p 546 1995. El análisis detallado ha mostrado que el motivo CG tiene que estar en un ciertocontexto de secuencia, y que tales secuencias son comunes en el ADN bacteriano pero son raras en el ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimuladora es a menudo: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que elmotivo de dinucleótido CG no está metilado, pero se sabe que otras secuencias de CpG no metiladas son

inmunoestimuladoras y se pueden usar en la presente invención.

También se ha mostrado que un oligonucleótido inmunoestimulador puede retener la actividad inmunológica cuando la Guanosina está mutada a un motivo 7-desazaguanosina (documento WO 03057822) .

Estos oligonucleótidos inmunoestimuladores se cree que tienen un pH ácido en solución, por ejemplo por debajo depH 7, tal como 6, 3, 6, 1 o inferior. Esto puede hacerlos difíciles de incorporar en las formulaciones líquidas de vacunas debido a que son diferentes a otros componentes en las formulaciones. Como se ha descrito esto puedeprovocar precipitación y / o problemas de estabilidad a largo plazo.

Se cree que estos oligonucleótidos inmunoestimuladores es probable que sean adyuvantes muy eficaces, particularmente cuando se usan en combinación con las combinaciones de adyuvantes existentes tales como 3D-MPL y QS21. Se espera que tales adyuvantes se empleen en enfermedades por las que hasta ahora ha sido difícil proporcionar vacunas eficaces, tal como VIH, cáncer y posiblemente malaria.

Existe un número de formas diferentes en las que los adyuvantes se pueden incluir en vacunas, pero se debenincluir de una forma que no afecte a la estabilidad o bien de ellos mismos o la composición antigénica y también deuna forma en la que no se coloque una carga excesiva sobre el profesional de la asistencia sanitaria quereconstituye la vacuna. La forma más sencilla de lograr esto sería colocar componentes adicionales en viales adicionales de manera que se mantengan separados hasta justo antes de la reconstitución, minimizando por lo tantoel tiempo durante el que los componentes pueden estar afectados entre sí. Esto significa que el antígeno y el oligonucleótido inmunoestimulador se proporcionarán cada uno de ellos en viales separados. Después si seemplean componentes adyuvantes adicionales tales como MPL y QS21 éstos se pueden proporcionar en forma deuna mezcla líquida en un tercer vial. Sin embargo, un número creciente de componentes en un número creciente de viales conduce a un incremento de costes, pérdidas y de manera importante a un incremento en la posibilidad deerrores durante la constitución.

Sumario de la invención Los presentes inventores han encontrado... [Seguir leyendo]

1. Una composición liofilizada que comprende uno o más antígenos no cargados positivamente y un oligonucleótidoinmunoestimulador que contiene CpG, en la que dicho uno o más antígenos es WT-1, o un derivado o fragmentodel mismo, en la que el derivado es bastante similar a los antígenos nativos para retener propiedades antigénicas

y seguir siendo capaz de permitir una respuesta inmune que sea alta contra el WT-1, y en la que el fragmento tiene al menos 8 aminoácidos de longitud y es capaz de inducir una respuesta inmune que presenta una reaccióncruzada con el WT-1 de origen natural.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho oligonucleótido inmunoestimulador comprende una secuencia Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina.

3. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicho oligonucleótido inmunoestimulador se selecciona entre el grupo que comprende:

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEC ID N.º:1) ;

TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEC ID N.º:2) ;

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEC ID N.º:3) ;

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEC ID N.º:4) ;

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEC ID N.º:5) .

4. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el oligonucleótidoinmunoestimulador contiene al menos dos repeticiones CG no metiladas que están separadas por al menos 3 nucleótidos.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el oligonucleótido inmunoestimulador contiene al menos dos repeticiones CG no metiladas que están separadas por 6 nucleótidos.

6. Un procedimiento de fabricación de una composición liofilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones1 a 5 que comprende las etapas de mezclar el antígeno deseado y el oligonucleótido inmunoestimulador conexcipientes adecuados, y someter la formulación resultante a un ciclo de liofilización.

7. Un procedimiento de fabricación de una composición inmunogénica que comprende las etapas de reconstitución de la composición liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con un vehículo adecuado.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicho vehículo es un vehículo particulado seleccionado entre el grupo que comprende sales minerales, emulsiones, polímeros, liposomas, ISCOM.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicho vehículo es una solución liposomal o una 30 emulsión de aceite en agua.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que dicho vehículo comprendeademás uno o más inmunoestimulantes.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho uno o más inmunoestimulantes se

seleccionan entre el grupo que consiste en agonistas del receptor de tipo Toll 4 (TLR 4) , antagonistas de TLR 4, 35 saponinas, agonistas de TLR7, agonistas de TLR8, agonistas de TLR9.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicho antagonista de TLR 4 es MPL 3desacilado.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicha saponina es QS21.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho vehículo comprende dos 40 inmunoestimulantes.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 en el que dichos inmunoestimulantes son MPL 3desacilado y QS21.

Figura 1 Figura 2

Figura 3

Vial 1 2 3

T0

semanas 37°C

semanas 37°C

semanas 37°C

Figura 4

Figura 5

Proteína LipoD1/3 - MAGE3 - HIS:

N term MDP protD 1/3 Met ASP Mage 3 GlyGly 7xHis C term

2 124

SEC ID N.º: 13

MDPKTLALSLLAAGVLAGCSSHSSNMANTQMKSDKIIIAH 40 RGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVV 80 IHDHFLDGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLE 120 MTENFETMDLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPAT 160 EEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPT 200 TMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKV 240 AELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSK 280 ASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDN 320 QIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEG 360 REDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLW 400 GPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGE 440 EGGHHHHHHH. 451

ROJO = secuencia señal 15 aa Azul = los 109 aminoácidos primeros de la Proteína D Rosa = aminoácidos no relacionados ∗ (MDP primeros aa de gripe)

∗ (Met-Asp en aa 128 - 129 para crear un sitio de clonación) )

∗ (Gly-Gly en 442 - 443) . Verde = fragmento de MAGE3; aminoácido.

3. 314 de MAGE3 (312 aminoácidos total) Naranja = cola 7 his

Figura 6 Figura 7

Figura 8

+CpG -CpG

Figura 9

NC SN P NC SN P

- CpG + CpG