Complejo de proteína que utiliza fragmento de inmunoglobulina y el método para su preparación.

Un conjugado de proteína que comprende un polipéptido fisiológicamente activo,

un polímero no-peptídico y un fragmento Fc de inmunoglobulina, en donde el polímero no-peptídico se liga de forma lineal en ambos extremos con el polipéptido fisiológicamente activo y el fragmento Fc de inmunoglobulina mediante un enlace covalente, y en donde el polímero no-peptídico es el polietileno glicol.

Complejo de proteína que utiliza fragmento de inmunoglobulina y el método para su preparación Campo Técnico La presente invención se relaciona con un conjugado de proteína que comprende un polipéptido fisiológicamente activo, un polímero no-peptídico y un fragmento Fc de inmunoglobulina, que se unen de forma covalente y tienen una duración prolongada de la acción fisiológica en comparación con la forma nativa.

Antecedentes de la Técnica Dado que los polipéptidos tienden a ser desnaturalizados fácilmente debido a su baja estabilidad, se degradan por las enzimas proteolíticas en la sangre y pasan fácilmente a través del riñón o el hígado, los medicamentos proteicos, que incluyen los polipéptidos como componentes farmacéuticamente efectivos, se deben administrar frecuentemente a los pacientes para mantener títulos y concentraciones en el nivel sanguíneo deseado. Sin embargo, esta administración frecuente de los medicamentos proteicos, especialmente por medio de inyección, causa dolor a los pacientes. Para resolver estos problemas, se han hecho muchos esfuerzos para mejorar la estabilidad en suero de los fármacos proteicos y mantener los fármacos en la sangre a niveles altos durante un periodo de tiempo prolongado, y de esta manera, maximizar la eficacia farmacéutica de los fármacos. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas con actividad sostenida, necesitan aumentar la estabilidad de los fármacos proteicos y mantener los títulos a niveles suficientemente altos sin causar respuestas inmunes en los pacientes.

Para estabilizar las proteínas y prevenir la degradación enzimática y la eliminación por los riñones, un polímero que tiene alta solubilidad, tal como polietileno glicol (de ahora en adelante, se refiere simplemente como "PEG") , se utilizó convencionalmente para modificar químicamente la superficie de un fármaco proteico. Al unirse con las regiones específicas o distintas de una proteína diana, el PEG estabiliza la proteína y previene la hidrólisis, sin causar graves efectos secundarios (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991) . Sin embargo, a pesar de su capacidad para mejorar la estabilidad de la proteína, este acoplamiento de PEG tiene problemas, como que reduce ampliamente el número de títulos de proteínas fisiológicamente activas. Además, el rendimiento disminuye con el incremento del peso molecular del PEG debido a la reactividad reducida de las proteínas.

Recientemente, se han sugerido los conjugados de fármaco proteico-polímero. Por ejemplo, como se describe en U.S. Pat. No. 5, 738, 846, un conjugado se puede preparar mediante el enlace de un fármaco proteico idéntico a ambos extremos de PEG, para mejorar la actividad del fármaco proteico. También, como se describe en International Pat. Publication No. WO 92/16221, dos fármacos proteicos diferentes se pueden unir a ambos extremos de PEG para proporcionar un conjugado que tiene dos actividades diferentes. Los anteriores métodos, sin embargo, no tuvieron mucho éxito en el mantenimiento de la actividad de los fármacos proteicos.

Por otra parte, Kinstler et al., reportaron que una proteína de fusión preparada mediante el acoplamiento del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) con albúmina humana mostró una mejora en la estabilidad (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12 (12) :1883-1888, 1995) . En esta publicación, sin embargo, ya que el fármaco modificado, que tiene una estructura G-CSF-PEG-albúmina, solo mostró un incremento de aproximadamente cuatroveces del tiempo de residencia en el cuerpo y un ligero incremento en la vida media en suero en comparación con la administración única del G-CSF nativo, no ha sido industrializado como una formulación de acción prolongada efectiva de los fármacos proteicos.

Un método alternativo para mejorar la estabilidad in vivo de las proteínas fisiológicamente activas, es mediante el enlace de un gen de proteína fisiológicamente activa con un gen codificante de una proteína que tiene alta estabilidad en suero, mediante tecnología de recombinación genética y cultivo de las células transfectadas con el gen recombinante para producir una proteína de fusión. Por ejemplo, una proteína de fusión se puede preparar mediante la conjugación de la albúmina, de una proteína conocida por ser la más efectiva para mejorar la estabilidad de la proteína, o su fragmento con una proteína fisiológicamente activa de interés por recombinación genética (International Pat. Publication Nos. WO 93/15199 y WO 93/15200, European Pat. Publication No. 413, 622) . Una proteína de fusión interferón alfa y albúmina, desarrollada por the Human Genome Science Company y comercializada con la marca comercial de 'Albuferon ™', aumentó la vida media de 5 horas a 93 horas en monos, pero se sabe que es problemático, ya que disminuye la actividad in vivo a menos del 5% de interferón alfa sin modificar (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303 (2) :540-548, 2002) .

Por otra parte, una inmunoglobulina (Ig) se compone principalmente de dos regiones: Fab que tiene un sitio de enlace de antígeno y Fc que tiene un sitio de enlace complemento. Se hicieron otros intentos para fusionar un fármaco proteico con un fragmento Fc de inmunoglobulina por recombinación genética. Por ejemplo, el interferón (Korean Pat. Laid-open Publication No. 2003-9464) , y el receptor interleucina-4, receptor interleucina-7 o receptor reitropoyetina (EPO) (Korean Pat. Registration No. 249572) fueron expresados previamente en mamíferos en una

forma fusionada con un fragmento Fc de inmunoglobulina. International Pat. Publication No. WO 01/03737 describe una proteína de fusión que comprende una citoquina o factor de crecimiento ligado a un fragmento Fc de inmunoglobulina a través de un ligador de oligopéptido.

Además, U.S. Pat. No. 5, 116, 964 revela una LHR (glicoproteína de superficie celular de linfocito) o proteína fusionada CD4 con un terminal amino o terminal carboxilo de una Fc de inmunoglobulina, fragmento por recombinación genética, y U.S. Pat. No. 5, 349, 053 describe una proteína de fusión de IL-2 y un fragmento Fc de inmunoglobulina. Otros ejemplos de proteínas de fusión Fc, preparadas por recombinación genética incluyen una proteína de fusión del interferón-beta o un derivado de esta y un fragmento Fc de inmunoglobulina (International Pat. Publication No. WO 00/23472) , una proteína de fusión del receptor IL-5 y un fragmento Fc de inmunoglobulina (U.S. Pat. No. 5, 712, 121) , una proteína de fusión del interferón alfa y un fragmento Fc de una inmunoglobulina G4 (U.S. Pat. No. 5, 723, 125) , y una proteína de fusión de la proteína CD4 y un fragmento Fc de una inmunoglobulina G2

(U.S. Pat. No. 6, 451, 313) . También, como se describe en U.S. Pat. No. 5, 605, 690, una variante de Fc que tiene un alteración de aminoácidos especialmente en un sitio de enlace complemento o sitio de enlace receptor se puede fusionar con el receptor TNF por tecnologías de ADN recombinante para proporcionar una proteína de fusión Fc TNFR-IgG1. De esta manera, los métodos de preparación de una proteína de fusión Fc utilizando un fragmento Fc de inmunoglobulina modificada por recombinación genética se revelan en U.S. Pat. Nos. 6, 277, 375, 6, 410, 008 y 6, 444, 792.

U.S. Pat. No. 6, 660, 843 revela un método de producción de un conjugado que comprende una proteína diana fusionada con un fragmento Fc de inmunoglobulina por medio de un ligador en E. coli por recombinación genética. Este método permite que el conjugado sea producido a un costo inferior que cuando se utiliza sistemas de expresión de mamífero y proporciona el conjugado en una forma aglicosilada. Sin embargo, dado que la proteína diana y el fragmento Fc de inmunoglobulina se producen juntos en E. coli, si la proteína diana es glicosilada en la naturaleza, es difícil aplicar dicha proteína diana utilizando este método. Este método tiene otro problema de expresión del conjugado como cuerpos de inclusión, dando lugar a velocidades de plegamiento muy altas.

Sin embargo, tales proteínas de fusión Fc producidas por recombinación genética tienen las siguientes desventajas: la fusión de la proteína ocurre solo en una región específica de un fragmento Fc de inmunoglobulina, el cual está en un extremo del terminal amino- o carboxilo-; solo las formas homodiméricas y las formas no-monoméricas se producen; y una fusión debería tener lugar solo entre las proteínas glicosiladas o entre las proteínas aglicosiladas, y es imposible hacer una proteína de fusión compuesta de una proteína glicosilada y una proteína aglicosilada.... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de proteína que comprende un polipéptido fisiológicamente activo, un polímero no-peptídico y un fragmento Fc de inmunoglobulina, en donde el polímero no-peptídico se liga de forma lineal en ambos extremos con el polipéptido fisiológicamente activo y el fragmento Fc de inmunoglobulina mediante un enlace covalente, y en donde el polímero no-peptídico es el polietileno glicol.

2. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno o más complejos del polipéptido fisiológicamente activo y el polímero no-peptídico se unen de forma covalente a una molécula única del fragmento Fc de inmunoglobulina.

3. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina es noglicosilado.

4. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina se compone de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste de los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4.

5. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina además incluye una región bisagra.

6. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de los fragmentos Fc IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, y las combinaciones e híbridos de estos.

7. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de los fragmentos Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y las combinaciones e híbridos de estos.

8. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG4.

9. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el fragmento Fc de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG4 aglicosilado humano.

10. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no-peptídico tiene un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste de un grupo aldehído, un grupo aldehído propione, un grupo butil aldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida.

11. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el derivado de succinimida es el succinimidil propionato, el succinimidil carboximetilo, el hidroxi succinimidil o el succinimidil carbonato.

12. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el polímero no-peptídico tiene un grupo reactivo aldehído como un grupo reactivo en ambos extremos de estos.

13. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no-peptídico se une en cada extremo de este, a un grupo reactivo libre en un extremo terminal amino, un residuo de lisina, un residuo de histidina

o un residuo de cisteina del fragmento Fc de inmunoglobulina y el polipéptido fisiológicamente activo.

14. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido fisiológicamente activo se selecciona a partir del grupo que consiste de hormonas, citoquinas, enzimas, anticuerpos, factores de crecimiento, factores reguladores de la transcripción, factores de coagulación, vacunas, proteínas estructurales, proteínas ligandos y los receptores.

15. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el polipéptido fisiológicamente activo se selecciona a partir del grupo que consiste de la hormona humana de crecimiento, hormona de liberación de la hormona de crecimiento, péptido de liberación de la hormona de crecimiento, interferones, receptores del interferón, factores de estimulación de colonias, receptor acoplado a la proteína-G, similar al glucagón, interleucinas, receptores de la interleucina, enzimas, proteínas de enlace de la interleucina, proteínas de enlace de la citoquina, factor de activación del macrófago, péptido macrófago, factor de célula B, factor de célula T, proteína A, inhibidor de alergias, glicoproteínas de necrosis celular, inmunotóxina, linfotóxina, factor de necrosis tumoral, supresores tumorales, factor de crecimiento de metástasis, alfa-1 antitripsina, albúmina, alfa-lactalbúmina, apolipoproteína-E, reitropoyetina, reitropoyetina altamente glicosilada, angiopoyetinas, hemoglobina, trombina, péptido activador del receptor de trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor activador del plasminogeno,

péptido de enlace de la fibrina, uroquinasa, estreptoquinasa, hirudina, proteína C, proteína reactiva C, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa, superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crecimiento óseo, proteína de estimulación ósea, calcitonina, insulina, atriopeptina, factor inductor de cartílago, elcatonina, factor activador del tejido conectivo, inhibidor de la ruta del factor tisular, hormona estimuladora del folículo, hormona luteinizante, hormona de liberación de la hormona luteinizante, factores de crecimiento nervioso, hormona paratiroide, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crecimiento similar a la insulina, hormona adrenocortical, glucagón, colecistoquinina, polipéptido pancreático, péptido de liberación de gastrina, factor de liberación de la corticotropina, hormona estimulante de la tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas del receptor, antígenos de superficie celular, antígenos de vacuna derivados de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, y fragmentos de anticuerpos.

16. El conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el polipéptido fisiológicamente activo es la hormona humana de crecimiento, el interferón alfa, el factor estimulante de colonias de granulocitos, la reitropoyetina o un fragmento de anticuerpo Fab'.

17. Un método de preparación del conjugado de proteína de la reivindicación 1, que comprende:

(a) el enlace de forma covalente de uno o más polímeros no-peptídicos que tienen un grupo reactivo en ambos extremos de estos, uno o más polipéptidos fisiológicamente activos y uno o más fragmentos Fc de inmunoglobulina; y

(b) aislamiento del citado conjugado de proteína, que comprende el polipéptido fisiológicamente activo, polímero nopeptídico y fragmento Fc de inmunoglobulina ligados de forma covalente, en donde el polímero no-peptídico es el polietileno glicol.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la etapa (a) comprende:

(a1) el enlace de forma covalente de un fragmento Fc de inmunoglobulina o polipéptido fisiológicamente activo con un extremo de un polímero no-peptídico activo;

(a2) aislamiento de un complejo que comprende el fragmento Fc de inmunoglobulina o polipéptido fisiológicamente activo unido al polímero no-peptídico de una mezcla de reacción resultante; y (a3) el enlace de forma covalente de un fragmento Fc de inmunoglobulina o polipéptido fisiológicamente activo con el otro extremo del polímero no-peptídico del complejo aislado para proporcionar un conjugado de proteína que comprende el fragmento Fc de inmunoglobulina y el polipéptido fisiológicamente activo, que se unen a cada extremo del polímero no-peptídico.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde, en la etapa (a1) , se utilizan el polipéptido fisiológicamente activo y el polímero no-peptídico a una relación molar de reacción de 1:1.25 a 1:5.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde, en la etapa (a1) , se utilizan el fragmento Fc de inmunoglobulina y el polímero no-peptídico a una relación molar de reacción de 1:5 a 1:10.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde, en la etapa (a3) , se utilizan el complejo obtenido en la etapa (a2) y el fragmento Fc de inmunoglobulina o polipéptido fisiológicamente activo a una relación molar de reacción de 1:0.5 a 1:20.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde las etapas (a1) y (a3) se llevan a cabo en la presencia de un agente reductor.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el agente reductor se selecciona a partir del grupo que consiste de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) , borohidruro de sodio, dimetilamina borato y piridina borato.

24. Una composición farmacéutica para proporcionar un polipéptido fisiológicamente activo que ha mejorado la estabilidad y la duración in vivo, que comprende el conjugado de proteína de las reivindicaciones 1 a 16 como un componente efectivo y un portador farmacéuticamente aceptable de estos.