UN VECTOR Y UNA LÍNEA CELULAR DE EXPRESIÓN NOVEDOSOS PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE Y UN PROCESO DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE USANDO LOS MISMOS.

Un modulo de alta expresión inducible que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una dihidrofolato reductasa y una secuencia nucleotídica que está ligada con la secuencia nucleotídica y codifica un promotor de dihidrofolato reductasa del que se han eliminado una o más secuencias CCGCCC repetidas

[0001] La presente invención se refiere a un vector para la producción en masa de una proteína recombinante, a una línea celular de expresión para producir la proteína recombinante y a un procedimiento de producción y purificación de la proteína recombinante usando la línea celular. Más particularmente, la presente invención se refiere a un vector capaz de potenciar en gran medida la eficacia de la amplificación génica al debilitar artificialmente un promotor del gen de dihidrofolato reductasa, que es una secuencia de control transcripcional del gen, a una línea celular animal transformada con el vector y a un procedimiento de expresión de una proteína de interés usando la línea celular animal y purificando solo una forma altamente glucosilada de la proteína. Antecedentes de la técnica ES 2 366 061 T3 [0002] Se han usado una variedad de vectores y hospedadoras para la producción en masa de proteínas recombinantes. Se ha usado ampliamente E. coli, pero tiene una utilidad limitada en la producción de proteínas que necesitan glucosilarse o tienen estructuras complicadas. Estos problemas pueden superarse usando células animales, células de levadura, animales transformados, plantas transformadas y similares. [0003] La levadura es ventajosa en la producción en masa de proteínas, pero es bien conocido que la glucosilación de levadura es diferente de la glucosilación humana y que es por tanto altamente inmunogénica (Hermeling y col., Pharm. Res. 21(6): 897-903 (2004)). No se han comercializado animales transformados debido a la dificultad en el cuidado y el mantenimiento de los animales y a la potencial contaminación con patógenos microbiológicos. [0004] El uso de líneas celulares animales está gravado por el alto coste de la producción de proteína y el tiempo y los gastos requeridos para el establecimiento de una línea celular, pero se usa muy comúnmente para la producción de proteína recombinante porque este sistema produce proteína recombinante de forma muy similar a la observada en células humanas y posibilita una producción y mantenimiento de proteína estables. Sin embargo, cuando se transforman para la producción de proteína recombinante, la mayoría de líneas celulares animales exhiben bajos niveles de expresión y por tanto no se han usado todavía para realizar una producción de alto rendimiento. La amplificación génica es la estrategia que se usa rutinariamente para superar los problemas asociados a los sistemas de expresión de células animales. Los dos sistemas de amplificación usados ampliamente son amplificación basada en dihidrofolato reductasa (DHFR) y amplificación basada en glutamina sintetasa, pudiendo ambas aumentar considerablemente el rendimiento de proteína recombinante de las líneas celulares animales. A pesar de su ventaja de mejorar la producción de proteína, los sistemas de amplificación génica tienen los inconvenientes de que requieren múltiples ciclos de amplificación génica para usar altas concentraciones de metotrexato (de aquí en adelante, designado simplemente como "MTX"), que consumen tiempo, y el subcultivo a largo plazo de líneas celulares conduce a una pérdida génica y una expresión inestable. [0005] Se han realizado muchos intentos por superar los inconvenientes de los sistemas de amplificación génica. Por ejemplo, la patente coreana de número de registro 0162021 emplea un gen de DHFR que se sitúa bajo el control de un promotor de SV40 parcialmente eliminado. La patente coreana de número de registro 0493703 describe la introducción de una mutación en un promotor de citomegalovirus (CMV) de modo que se altere la afinidad de la proteína de unión a ADN metilada por su secuencia de reconocimiento en el promotor. La patente coreana de número de registro 0184778 emplea la región 5 no codificante de una proteína de unión (Bip) a la cadena pesada de inmunoglobulina como sitio de entrada interno de ribosoma (IRES) para poner un gen de DHFR bajo el control no de un promotor independiente, sino de una secuencia de control de la transcripción de una proteína recombinante de interés. [0006] La patente coreana de número de registro 0162021 estaba dirigida al control de la actividad del promotor de SV40 eliminando de 128 a 270 nucleótidos. Sin embargo, no es conocido exactamente el papel de la secuencia eliminada, y no se menciona el papel de la secuencia restante. En particular, debido a que esta patente no muestra que la amplificación génica no aumenta más a concentraciones de MTX mayores de 20 nM en condiciones que no contengan un control, no proporciona apoyo alguno al cambio de la actividad del promotor de DHFR y a la expresión optimizada a baja concentración de MTX. La patente coreana de número de registro 0493703 pretendía conseguir una amplificación génica eficaz modificando la secuencia de reconocimiento de proteína de unión a ADN metilada en el promotor de CMV, pero el efecto de amplificación sobre la expresión es menor que en otros procedimientos. En la patente coreana de número de registro 0184778, la expresión dependiente de IRES, realizada en lugar del uso de un promotor independiente, permite la amplificación génica meramente a niveles de MTX tan bajos como de varios micromoles (µM) y un aumento de expresión de aproximadamente 30 veces. Por tanto, la amplificación del gen de DHFR no puede predecirse a partir de la modificación de un promotor genérico, y la aplicación de un promotor modificado se determinará solo cuando la amplificación génica se efectúe usando 2 sustancialmente varias clases de promotores. [0007] La eritropoyetina humana (EPO), que se ilustra como un ejemplo de proteínas recombinantes de la presente invención, es una glucoproteína de aproximadamente 34 kDa, pero la masa molecular de la cadena peptídica (EPO no glucosilada) es solo de aproximadamente 18 kDa. La EPO se sintetiza en el riñón en respuesta a anemia, hipoxia o hemorragia, y estimula la producción de eritrocitos y mantiene la hemostasia. La EPO está presente en aproximadamente 10 a 20 mUI/ml en adultos, y la disfunción renal produce una anemia grave (Jacobson, y col., Nature, 179: 633-634 (1957)). Por tanto, la EPO se ha usado como agente terapéutico para insuficiencia renal crónica y anemia causada por diversos factores. En el pasado, la EPO se recogía del plasma sanguíneo de animales, o de la sangre u orina de pacientes con anemia aplásica, que producen EPO a niveles mayores que las personas sanas, pero la EPO se obtiene en forma inestable y con bajo rendimiento. La EPO urinaria de personas sanas se obtiene a bajas concentraciones, y requiere una gran purificación porque la orina contiene un inhibidor de la actividad de la EPO (véanse las patentes de EE.UU. nº 4.397.840, 4.303.650 y 3.865.810). Puesto que es difícil obtener grandes cantidades de EPO de alta pureza a partir de la sangre o la orina, se han desarrollado procedimientos de preparación de EPO usando técnicas de recombinación genética. Sin embargo, puesto que se requiere glucosilación para la actividad in vivo de la EPO, cuando se clona y expresa un gen de EPO en E. coli o levadura, la EPO no está glucosilada en su forma nativa, y por tanto no exhibe su actividad biológica. Por ello, el uso de una línea celular animal recombinante es esencialmente necesario para la producción de EPO. En el caso de usar una línea celular animal recombinante, la EPO se produce habitualmente basándose en un sistema de amplificación génica de DHFR (Malik y col., DNA and Cell Bio., 6: 453-459 (1992)). Descripción de la invención Problema técnico [0008] Basándose en un estudio previo realizado por Michel Fromm y Paul Berg (J. Mol. Appl. Genet. 1983. 2(1): 127-135), que sugería que seis secuencias repetidas ricas en GC en una región promotora ligada a un gen estructural de DHFR son importantes para la actividad transcripcional del promotor, los inventores de esta solicitud construyeron un vector de expresión para células animales que es más eficaz en la amplificación y expresión génica eliminando secuencialmente las secuencias ricas en GC, conduciendo así a la presente invención. Solución técnica [0009] Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un vector de expresión que sea más eficaz en la amplificación génica para la producción de una proteína recombinante en células animales. [0010] Es otro objeto de la presente invención proporcionar una línea celular animal transformada con el vector de expresión. [0011] Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción en masa de una proteína recombinante usando la línea celular animal. Breve descripción de los dibujos ES 2 366 061 T3 [0012] La FIG. 1 representa esquemáticamente un proceso de construcción de los vectores de expresión X1GC/dhfr, X3GC/dhfr y X6GC/dhfr, que contienen secuencias ricas en... [Seguir leyendo]

1. Un modulo de alta expresión inducible que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una dihidrofolato reductasa y una secuencia nucleotídica que está ligada con la secuencia nucleotídica y codifica un promotor de dihidrofolato reductasa del que se han eliminado una o más secuencias CCGCCC repetidas. 2. El módulo de alta expresión inducible según la reivindicación 1, en el que el promotor de dihidrofolato reductasa contiene una o cero secuencias CCGCCC repetidas 3. El módulo de alta expresión inducible según la reivindicación 1, que tiene una secuencia nucleotídica cualquiera seleccionada del grupo constituido por las representadas por las SEQ ID Nos. 7 a 10. 4. Un vector de expresión que comprende el módulo de alta expresión inducible de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. El vector de expresión según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un gen que codifica un polipéptido fisiológicamente activo. 6. El vector de expresión según la reivindicación 5, en el que el polipéptido fisiológicamente activo es eritropoyetina humana. 7. El vector de expresión según la reivindicación 6, que tiene una secuencia nucleotídica cualquiera de las seleccionadas del grupo constituido por las representadas por las SEQ ID Nos. 1 a 4. 8. El vector de expresión según la reivindicación 4, que tiene una secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 5 o 6. 9. Una línea celular transformada con el vector de expresión de la reivindicación 8. 10. La línea celular según la reivindicación 9, que tiene los números de acceso KCTC10991BP o KCTC10992BP. 11. Una línea celular transformada con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7. 12. La línea celular según la reivindicación 11, que es una línea celular de CHO. 13. La línea celular según la reivindicación 12, en la que la línea celular de CHO es deficiente en el gen de dihidrofolato reductasa. 14. La línea celular según la reivindicación 12, que tiene los números de acceso KCTC10993BP, KCTC10994BP o KCTC10995BP. 15. Un procedimiento de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de: (a) transformar una línea celular animal con un vector de expresión que incluye un gen que codifica la dihidrofolato reductasa que contiene un promotor del que se han eliminado parcial o completamente las secuencias CCGCCC repetidas y un gen que codifica una proteína recombinante; y (b) cultivar la línea celular animal transformada en presencia de un inhibidor de dihidrofolato reductasa. 16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la proteína recombinante es eritropoyetina humana 17.El procedimiento según la reivindicación 16, que comprende adicionalmente purificar eritropoyetina que tiene un alto contenido de ácido siálico. 18. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que el vector de expresión es un vector de expresión mostrado en la FIG. 1. 19.El procedimiento según la reivindicación 15 o 16, en el que la línea celular animal de la etapa (a) es una línea celular de CHO deficiente en dihidrofolato reductasa. 20. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la línea celular animal transformada de la etapa (b) tiene los números de acceso KCTC10993BP, KCTC10994BP o KCTC10995BP. 42 ES 2 366 061 T3 43 ES 2 366 061 T3 44 ES 2 366 061 T3 ES 2 366 061 T3 46 ES 2 366 061 T3 47 ES 2 366 061 T3 48 ES 2 366 061 T3 49 ES 2 366 061 T3