Chip de análisis y método de análisis.

Un chip de análisis que comprende: un sustrato que tiene una superficie en la que se inmoviliza (n) una (s) sustancia (s) de fijación selectiva;

un elemento de cubierta adherido a dicho sustrato; un hueco entre dicho sustrato y dicho elemento de cubierta; y partículas contenidas o inyectadas de forma movible en dicho hueco; estando las superficies de dichas partículas revestidas con un/unos tensioactivo (s).

Chip de análisis y método de análisis Campo de la invención: La presente invención se refiere a un chip de análisis que tiene un sustrato en el que se inmoviliza una sustancia capaz de fijarse a una sustancia de ensayo de forma selectiva, es decir, una sustancia de fijación selectiva y un método analítico para la sustancia de ensayo utilizando el chip de análisis.

Antecedentes de la técnica: Un chip de análisis tiene un sustrato en el que se inmoviliza una sustancia de fijación selectiva tal como un gen, proteína, lípido, sacárido o similares, cuya sustancia de fijación selectiva en el sustrato se le permite reaccionar con una sustancia de ensayo, la cual normalmente se encuentra en forma de solución y, del resultado de la reacción, se analiza la presencia o ausencia, condición o cantidad de la sustancia de ensayo. Los ejemplos de este sustrato generalmente incluyen aquellos hechos en vidrio, metal o resina.

En una realización de un chip de análisis, existe un chip de análisis llamado micromatriz, cuyo sustrato tiene moléculas tales como ADN que se depositan en el mismo a una alta densidad con el propósito de analizar la expresión de cientos a decenas de miles de numerosos genes al mismo tiempo. Al utilizar micromatrices, los análisis sistemáticos y exhaustivos de expresión genética pueden realizarse en diversos modelos de enfermedades animales y en fenómenos celulares biológicos. En particular, las funciones de los genes, es decir, las proteínas codificadas por los genes, pueden clarificarse y el momento de la expresión de las proteínas y los lugares donde estas actúan pueden identificarse. Se cree que buscar genes patológicos y generes terapéuticos y que encontrar métodos terapéuticos al analizar la variación en la expresión genética en organismos a nivel celular o de tejidos con los micromatrices y construir bases de datos para perfiles de expresión genética al combinar los datos resultantes con datos sobre fenómenos fisiológicos, biológico celulares y bioquímicos es posible.

En este momento, dos métodos básicos, es decir el método de Chip Genético y el método de chip de análisis ADNc, se utilizan para la preparación de chips de análisis.

El método de Chip Genético es un método desarrollado por Affymetrix, en el que se sintetizan oligo ADNs de aproximadamente 25 mer en una placa de vidrio por fotolitografía, cuyos oligo ADNs de 25 mer se diseñan con base en las secuencias base de 16 a 20 regiones por gen y el grupo de los 25 mers perfectamente apareados y el grupo de oligómeros con un desapareamiento en una base, el cual se introduce de forma intencional al cambiar la 13ª base, se utilizan en conjunto como ADN sonda. Debido a que, en este método, las longitudes de los ADN sonda son constantes y se conocen sus secuencias, el contenido GC, que afecta la intensidad de hibridación, puede hacerse constante, de tal forma que el chip anterior se considera como un chip de análisis ideal para un análisis de expresión cuantitativa. Por otro lado, el método de chip de análisis ADNc es un método desarrollado por la Universidad de Stanford, en el que el ADN se inmoviliza en una placa de vidrio por un método tal como el método de aplicación puntual o el método de chorro de tinta. Cuando se utiliza un chip de análisis preparado con cualquiera de estos métodos, una muestra (gen) a ser medida, la cual se marcó de forma fluorescente con anterioridad, se le permite fijarse al ADN sonda en el chip de análisis por hibridación y la intensidad de su fluorescencia se mide con un escáner para analizar la expresión genética.

Un ejemplo de análisis de datos de chip de análisis es el agrupamiento jerárquico. Con este método, los genes con patrones de expresión similares se agrupan para preparar un árbol filogenético y los niveles de expresión de muchos genes se representan de forma esquemática con colores diferentes. Dicho agrupamiento permite la identificación de genes relacionados con ciertas enfermedades.

Los chips de análisis se utilizan cada vez más como método para ensayar y analizar no solo ácidos nucleicos tales como el ADN sino también proteínas y sacáridos. Especialmente, en chips para el análisis de proteínas, las proteínas tales como anticuerpos, antígenos y sustratos enzimáticos se inmovilizan en el sustrato.

Cuando se utilice un chip de análisis, es importante aplicar una solución preparada que contenga la sustancia de ensayo de tal forma que la solución se extienda de forma uniforme sobre la región en el chip de análisis donde se inmovilice la sustancia de fijación selectiva. Para lograr lo anterior, se conocen chips de análisis que cuentan con partículas dentro para agitar la solución que contiene la sustancia de ensayo.

La Literatura de Patente 1 devela un chip de análisis en el que una dispersión de partículas preparada al añadir partículas a una sustancia de ensayo de solución de ADN se aplica al chip de análisis, el cual luego se cubre con una cubierta de vidrio y se sella con un agente sellante. El chip de análisis permite la hibridación con agitación utilizando el movimiento de las partículas, sin que la sustancia de ensayo se evapore.

La Literatura de Patente 2 devela un chip de análisis en el que las irregularidades se proporcionan en el sustrato del chip de análisis y se inmoviliza una sustancia de fijación selectiva en las porciones sobresalientes de las irregularidades y las partículas para agitación se contienen de forma movible en las porciones empotradas de las

mismas, para permitir la agitación de la solución de reacción. Debido a que, en este chip de análisis, las partículas se mantienen alejadas de las superficies superiores de las porciones sobresalientes, la agitación con las partículas puede realizarse sin dañar la sustancia de fijación selectiva.

Sin embargo, en los chips de análisis donde la agitación se lleva a cabo utilizando las partículas tal como se describe anteriormente, cuando la solución que contiene la sustancia de ensayo se aplica a las mismas, pueden permanecer burbujas en la superficie dentro del sustrato del chip de análisis o sobre la superficie de las partículas, o pueden generarse en la solución de reacción. Existe el problema que las burbujas generadas inhiban la reacción entre la sustancia de fijación selectiva y la sustancia de ensayo en las áreas donde permanecen las burbujas. Además, existe un problema de falta de uniformidad de la reacción entre las áreas donde permanecen las burbujas y las demás áreas, el cual causa una desviación en la sensibilidad de detección o una disminución en la sensibilidad de detección.

El documento EP 1 729 136 describe un chip de análisis que contiene partículas utilizadas para mezclar.

Además, cuando las partículas para agitar están contenidas o se inyectan en el hueco entre el sustrato del chip de análisis y la cubierta, la operación de inyectar las partículas en el espacio puede ser difícil o la inyección de una cantidad suficiente de partículas puede no llevarse a cabo debido a la generación de electrostática o por razones similares. Además, las partículas inyectadas pueden acumularse y tornarse inmóviles y, en casos donde la solución de la sustancia de ensayo se inyecta en el hueco rodeado por la cubierta y el sustrato en esas condiciones, la solución no penetra las áreas donde las partículas se acumulan, lo que resulta en un atrapamiento de burbujas, lo que causa falta de uniformidad en la reacción.

Literatura de Patente 1 JP 3557419 B Literatura de Patente 2 WO 2005/090997

Divulgación de la invención:

Problemas a ser resueltos por la invención: La presente invención se plantea para resolver los anteriores problemas y proporciona un chip de análisis el cual suprime la generación de burbujas que inhiben la reacción selectiva entre una sustancia de ensayo y una sustancia de fijación selectiva inmovilizada, reduciendo así la desviación de la sensibilidad de detección y la disminución de la sensibilidad de reducción causadas por la falta de uniformidad de la reacción. La presente invención también proporciona un chip de análisis que impide la acumulación de partículas para agitación y simplifica la inyección de partículas para agitación en el hueco entre el sustrato del chip de análisis y su cubierta.

Medios para resolver los problemas: Los presentes inventores investigaron de forma exhaustiva para descubrir que los anteriores problemas podían resolverse al revestir la superficie de las partículas para agitación... [Seguir leyendo]

1. Un chip de análisis que comprende:

un sustrato que tiene una superficie en la que se inmoviliza (n) una (s) sustancia (s) de fijación selectiva; un elemento de cubierta adherido a dicho sustrato; un hueco entre dicho sustrato y dicho elemento de cubierta; y partículas contenidas o inyectadas de forma movible en dicho hueco; estando las superficies de dichas partículas revestidas con un/unos tensioactivo (s) .

2. El chip de análisis de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho tensioactivo revestido sobre dichas superficies de dichas partículas es un tensioactivo aniónico o un tensioactivo no iónico.

3. El chip de análisis de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho sustrato comprende una región irregular compuesta por porciones empotradas y porciones sobresalientes y dicha (s) sustancia (s) de fijación selectiva se inmoviliza (n) en las superficies superiores de dichas porciones sobresalientes.

4. El chip de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el material que constituye dichas partículas revestidas con dicho (s) tensioactivo (s) comprende una cerámica.

5. El chip de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que uno o más agujeros penetrantes que se comunican con dicho hueco se forman en dicho elemento de cubierta.

6. El chip de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la distancia más corta entre dicha superficie de dicho sustrato en el que se inmoviliza (n) dicha (s) sustancia (s) de fijación selectiva y dicho elemento de cubierta es menor que el diámetro de dichas partículas.

7. El chip de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha sustancia de fijación selectiva es un ADN, ARN, proteína, péptido, sacárido, cadena de azúcar o lípido.

8. Un método para analizar una sustancia de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de:

poner en contacto dicho chip de análisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en contacto con una solución que contiene una sustancia de ensayo, fijando de esa manera dicha sustancia de ensayo a dicha sustancia de fijación selectiva inmovilizada en la superficie de dicho sustrato; y medir la cantidad de dicha sustancia fijada a dicho chip de análisis a través de dicha sustancia de fijación selectiva.

9. El método para analizar una sustancia de ensayo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha solución que contiene dicha sustancia de ensayo se somete a un tratamiento de desgasificación antes de poner a dicha solución que contiene la sustancia de ensayo en contacto con dicho chip de análisis.