CCaMK quinasas implicadas en la nodulación y la endomicorrización.

Método para regular la nodulación y/o la endomicorrización en una planta,

comprendiendo dicho métodomodular la expresión o la actividad en dicha planta de una proteína quinasa dependiente del Ca2+- calmodulina(CCaMK).

CCAMK quinasas implicadas en la nodulación y la endomicorrización La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos que están implicados en la nodulación y la micorrización en plantas.

Una amplia variedad de plantas terrestres son capaces de asociarse, a través de su sistema radicular, con simbiontes microbianos.

Los más conocidos de estos sistemas endosimbióticos son aquellos que se producen entre las bacterias del suelo denominadas colectivamente como rhizobia y las raíces de muchas especies de legumbres (familia Leguminosae) . La simbiosis legumbre-rizhobia fija tanto el nitrógeno existente como el procedente de la industria de los abonos químicos, gracias a la capacidad de las bacterias rizhobia de inducir la morfogénesis de nuevos órganos en la planta, nódulos en la raíz de las legumbres, con el que fijan nitrógeno.

Otro tipo importante de relaciones simbióticas entre plantas y microorganismos es la simbiosis de micorrizas arbusculares (MA) , que se da no sólo en las legumbres, sino también en la mayoría de las plantas terrestres (una excepción notable es la familia Brassicaceae, que incluye la Arabidopsis thaliana) , e implica hongos del orden Glomales (GIANINAZZI-PEARSON, Plant Cell, vol. 8, pág. 1871, 1996; HARRISON, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 50, pág. 361, 1999; BRUNDRETT, New phytologist, vol. 154, pág. 275, 2002) .

Aunque a primera vista pueda parecer que la simbiosis legumbre-rhizobia y la simbiosis MA no tienen mucho en común, tanto las parejas fúngicas como las bacterianas tienen una capacidad sumamente restringida para desencadenar un programa genético en una planta hospedadora que permita una infección controlada y localizada.

Los estudios sobre la simbiosis legumbre-rhizobia han llevado a identificar la estructura e importancia de las señales rizobianas, los factores Nod lipo-quito-oligosacáridos, que inician respuestas simbióticas en las raíces de las legumbres hospedadoras y son necesarias para el reconocimiento, la infección controlada y la formación de nódulos (DÉNARIÉ, y col., Annu Rev Biochem, vol. 65, pág. 503, 1996; LEROUGE y col., Nature, vol. 344, pág. 781, 1990; GEURTS and BISSELING, Plant Cell, vol. 14, Suppl, S239, 2002) . A concentraciones pico-nano molares, estas moléculas inducen diversas respuestas, incluyendo la afluencia rápida y el pulso del calcio, inducción génica específica, alteraciones en la morfología celular epidérmica y mitosis celular cortical (GEURTS and BISSELING, 2002, arriba mencionado) .

Estudios genéticos en modelos de legumbre Medicago truncaluta y Lotus japonicus han llevado a identificar genes implicados en la percepción y transducción de los factores Nod. Recientemente se han clonado genes que codifican para dos tipos de serina/treonina-quinasas de tipo receptor transmembrana con regiones putativas extracelulares que contienen dominios LysM (LysM-RLKs) , necesarias para las respuestas relativas a los factores Nod y a la infección rizobiana (RADUTOIU y col., Nature, vol. 425, pág. 585, 2003; LIMPENS y col., Science, vol. 302, pág. 630, 2003; MADSEN y col., Nature, vol. 425, pág. 637, 2003) . Existe la hipótesis de que los productos génicos forman receptores de factor Nod heterodiméricos (RADUTOIU y col., 2003, arriba mencionado) .

Aguas abajo estos genes, se han mapeado tres genes en M. truncatula, DMI1, DMI2 y DMI3, necesarios tanto para la nodulación como para la formación de micorrizas arbusculares (simbiosis MA) . Los mutantes en DMI1, DMI2 y DMI3 están bloqueados para la mayoría de las respuestas a factores Nod: tienen un fenotipo similar y no inducen ramificación del pelo radicular (sino que, en su lugar, provocan hinchamiento del pelo) , ni expresión génica de nodulina temprana, ni división celular cortical (CATOIRA y col., Plant Cell, vol. 12, pág. 1647, 2000) . Sin embargo, se diferencian en su capacidad para responder a los factores Nod mediante la inducción de oscilaciones rápidas de la concentración de calcio citoplasmático (pulso de calcio) , que se pierde en los mutantes dmi1 y dmi2, pero no en dmi3 (EHRHARDT y col., Cell, vol. 85, pág. 673, 1996; WAIS y col., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 97, pág. 13407, 2000) . Además, los mutantes en los genes DMI1 y DMI2 (= NORK) , que son incapaces de formar nódulos y micorrizas (CATOIRA y col., 2000, arriba mencionado) , son defectivos para la mayoría de las respuestas a factores Nod, incluyendo la respuesta del pulso del calcio, pero aún son capaces de generar la respuesta de afluencia rápida del calcio (EHRHARDT y col., 1996, arriba mencionado; SHAW and LONG, Plant Physiol, vol. 131, pág. 976, 2003) .

Recientemente se ha demostrado que DMI2 codifica una proteína quinasa de tipo receptor LRR (NORK; ENDRE y col., Nature, vol. 417, pág. 962, 2002) .

Los inventores han aislado y caracterizado ahora el gen DMI3 de M. truncatula y han descubierto que codifica un miembro de la pequeña familia vegetal de proteína quinasas dependientes de Ca2+-calmodulina quiméricas. También han identificado el gen DMI3 ortólogo en el guisante.

En diversas plantas se han descrito miembros del grupo CCaMK, que van desde el musgo Physcomitrella hasta plantas superiores, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. DMI3 es muy similar a las CCaMK del arroz, el tabaco y el lirio (73, 5% de identidad entre CCaMK de lirio y Medicago) . Todas estas proteínas comparten con las proteína quinasas vegetales dependientes del calcio (CDPK) más comunes un dominio quinasa N-terminal. Sin embargo, se diferencian de las CDPK en la estructura de su dominio regulador de unión de calcio C-terminal, que es más similar a un dominio de tipo visinina de mamífero (con tres manos EF de unión al Ca) que al dominio de tipo calmodulina típico de las CDPK (con cuatro manos EF) . Entre el dominio quinasa y el dominio de unión de calcio se halla un dominio de unión de calmodulina que está solapado a un dominio autorregulador. Esta estructura permite regular la actividad de la quinasa tanto mediante el calcio como mediante la calmodulina (SATHYANARAYANAN y col., J Biol Chem, vol. 276, pág. 32940, 2001; TAKEZAWA y col., J Biol Chem, vol. 271, pág. 8126, 1996) .

La Figura 1 muestra la comparación de CCaMK de M. truncatula (MtCCaMK) y P. sativum (PsCCaMK) , caracterizadas por los inventores con respecto a CCaMK previamente caracterizadas de lirio (LlCCaMK: U24188) , arroz (OsCCaMK: AK070533) , tabaco (NtCCaMK: AF087813) y Physcomitrella (PpCCaMK: AY155462) . Sobre las secuencias se indica el dominio de serina/treonina quinasa ( ) , el sitio de unión de calmodulina ( ) , los motivos de mano EF de unión de calcio ( ) y el sitio de autofosforilación (*) de las CCaMK. Bajo las secuencias se indica la firma del sitio activo de quinasa ( ) . Entre las posiciones 60 y 75 de la secuencia de CCaMK de M. truncatula puede detectarse una señal de localización nuclear bipartita putativa, pero ésta no está presente en la secuencia de P. sativum.

Se sabe poco del papel biológico de las CCaMK en las plantas. El hecho de que las CCaMK del lirio, el tabaco y el arroz se expresen de manera preferente en puntas de raíces y anteras en desarrollo (POOVAIAH y col., Planta, vol. 209, pág. 161, 1999; WANG and POOVAIAH, J Biol Chem, vol. 274, pág. 12001, 1999) ha llevado a sugerir que podrían desempeñar un papel en la mitosis y la meiosis (YANG and POOVAIAH, Trends Plant Sci, vol. 8, pág. 505, 2003) .

Los inventores demuestran aquí por primera vez, mediante el uso de mutantes de DMI3, que una CCaMK desempeña un papel en la vía de señalización que conduce a la endomicorrización y en el proceso de desarrollo de la nodulación en las legumbres. DMI3 parece actuar inmediatamente aguas abajo del pulso del calcio y aguas arriba de todas las demás respuestas simbióticas. Sin ceñirse a ningún mecanismo en particular, puede plantearse la hipótesis de que el pulso del calcio, y no la afluencia rápida de calcio, es la firma del calcio reconocida por DMI3, cuyo papel sería traducir esta señal a diversos componentes celulares que controlan las respuestas de nodulación y micorrización.

Los descubrimientos de la presente invención permiten suponer que las CCaMK previamente conocidas de las plantas no leguminosas, cuya función era desconocida hasta ahora, también desempeñan un papel en la endomicorrización en dichas plantas y, por tanto, que la modulación de la expresión o actividad de dichas CCaMK puede permitir regular la endomicorrización.

La presente invención proporciona medios para regular las respuestas de nodulación y/o endomicorrización... [Seguir leyendo]

1. Método para regular la nodulación y/o la endomicorrización en una planta, comprendiendo dicho método modular la expresión o la actividad en dicha planta de una proteína quinasa dependiente del Ca2+-calmodulina (CCaMK) .

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha CCaMK tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad o con al menos un 90% de semejanza con el polipéptido de SEQ ID nº: 2.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha CCaMK se selecciona de entre la CCaMK de Medicago truncatula, con SEQ ID nº: 2, y la CCaMK de Pisum sativum, con SEQ ID nº: 4.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la expresión o la actividad de 10 dicha CCaMK en la planta se incrementa para aumentar la nodulación y/o la endomicorrización.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la expresión o la actividad de dicha CCaMK en la planta se disminuye para reducir la nodulación y/o la endomicorrización.

6. Método para identificar un alelo de un gen de CCaMK, estando dicho alelo asociado a un fenotipo determinado de características de nodulación y/o endomicorrización y comprendiendo dicho método el aislamiento de un

fragmento de ácido nucleico que comprende el gen de CCaMK o una parte del mismo, a partir de como mínimo una planta que expresa dicho fenotipo, y la secuenciación de dicho fragmento.

7. Método para ensayar una planta en cuanto a sus características de nodulación y/o endomicorrización, comprendiendo dicho método la detección de si un alelo de un gen de CCaMK asociado a determinadas características de nodulación y/o endomicorrización está presente en dicha planta.