APTÁMEROS ESTABILIZADOS PARA FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE PLAQUETAS Y SU USO COMO AGENTES TERAPÉUTICOS ONCOLÓGICOS.

Aptámeros estabilizados para factor de crecimiento derivado de plaquetas y su uso como agentes terapéuticos oncológicos CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La invención se refiere generalmente al campo de los ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros que pueden unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) útiles como agentes terapéuticos en oncología y/u otras enfermedades o trastornos en los que participa PDGF. La invención se refiere además a materiales y a procedimientos para la administración de aptámeros que pueden unirse al factor de crecimiento derivado de plaquetas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen afinidad de unión específica por moléculas mediante interacciones distintas del apareamiento de bases de Watson-Crick clásico. [0003] Los aptámeros, al igual que los péptidos generados por expresión en fago o anticuerpos monoclonales (mAbs), pueden unirse específicamente a dianas seleccionadas y modular la actividad de la diana o interacciones de unión, por ejemplo, mediante la unión de aptámeros puede bloquearse el funcionamiento de la capacidad de su diana. Descubiertos por un procedimiento de selección in vitro de conjuntos de oligonucleótidos de secuencias al azar, se han generado aptámeros para más de 130 proteínas que incluyen factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un aptámero típico tiene 10-15 kDa de tamaño (20-45 nucleótidos), se une a su diana con afinidad nanomolar a subnanomolar y discrimina a dianas estrechamente relacionadas (por ejemplo, los aptámeros no se unirán normalmente a otras proteínas de la misma familia de genes). Una serie de estudios estructurales ha mostrado que los aptámeros pueden usar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrófobos, exclusión estérica) que accionan la afinidad y la especificidad en inmunocomplejos. [0004] Los aptámeros tienen varias características deseables para su uso como agentes terapéuticos (y de diagnóstico) que incluyen alta especificidad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas específicas con respecto a anticuerpos y otros agentes biológicos protéicos, por ejemplo: [0005] 1) Velocidad y control. Los aptámeros se producen por un procedimiento completamente in vitro que permite la rápida generación de cabezas de serie iniciales, que incluyen cabezas de serie terapéuticas. La selección in vitro permite que la especificidad y la afinidad del aptámero se controle exhaustivamente y permite la generación de cabezas de serie contra dianas tanto tóxicas como no inmunogénicas. [0006] 2) Toxicidad e inmunogenicidad. Los aptámeros como clase han demostrado toxicidad terapéuticamente aceptable y carecen de inmunogenicidad. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede estar gravemente limitada por la respuesta inmunitaria a los propios anticuerpos, es extremadamente difícil provocar anticuerpos dirigidos contra aptámeros, lo más probablemente debido a que los aptámeros no pueden ser presentados por linfocitos T mediante el MHC y la respuesta inmunitaria está generalmente entrenada para no reconocer fragmentos de ácido nucleico. [0007] 3) Administración. Mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos de anticuerpos actualmente aprobados se administran por infusión intravenosa (normalmente durante 2-4 horas), los aptámeros pueden administrarse por inyección subcutánea (la biodisponibilidad del aptámero por administración subcutánea es >80% en estudios en mono (Tucker y col., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). Con buena solubilidad (>150 mg/ml) y peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa), una dosis semanal de aptámero puede administrarse por inyección en un volumen inferior a 0,5 ml. Además, el pequeño tamaño de los aptámeros permite que penetren en el área de limitaciones conformacionales que no permite que penetren anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, que presenta todavía otra ventaja de los agentes terapéuticos basados en aptámeros o profilaxis. [0008] 4) Escalabilidad y coste. Los aptámeros terapéuticos se sintetizan químicamente y por consiguiente pueden escalarse fácilmente según se necesite para cumplir la demanda de producción. Mientras que las dificultades en el escalado de la producción están limitando actualmente la disponibilidad de algunos agentes biológicos y el coste de capital de una planta de producción de proteínas a gran escala es enorme, un único sintetizador de oligonucleótidos a gran escala puede producir más de 100 kg/año y requiere una inversión inicial relativamente modesta. El coste actual de los artículos para la síntesis de aptámeros a la escala de kilogramo se estima en 500 $/g, comparable al de anticuerpos altamente optimizados. Se esperan mejoras continuas en el desarrollo de procedimientos para reducir el coste de los artículos a < 100 $/g en cinco años. 2   [0009] 5) Estabilidad. Los aptámeros terapéuticos son químicamente consistentes. Están intrínsecamente adaptados para recuperar la actividad tras la exposición a factores tales como calor y desnaturalizantes y pueden almacenarse durante periodos prolongados (>1 año) a temperatura ambiente como polvos liofilizados. Presión del líquido intersticial [0010] Los tres tipos de tratamiento contra el cáncer más comunes son extirpación quirúrgica de tejido canceroso, radioterapia para destruir tejido canceroso y quimioterapia. Estos tratamientos tienen como objetivo extirpar los tejidos o células cancerosas o destruirlos en el cuerpo con agentes terapéuticos u otros agentes. La quimioterapia sigue siendo una modalidad de tratamiento importante para tumores sólidos. Para reducir posiblemente los efectos secundarios tóxicos y para lograr mayor eficacia de fármacos quimioterapéuticos, son altamente deseables estrategias para mejorar la distribución de fármacos entre tejidos normales y tumores. [0011] Un obstáculo importante en el tratamiento de tumores sólidos es la captación limitada de agentes terapéuticos en el tejido tumoral. La presión del líquido intersticial (PLI) elevada es una de las propiedades fisiológicamente características de tumores sólidos que se diferencian de tejido conjuntivo sano y se considera que es el principal obstáculo que limita la difusión libre de agentes terapéuticos en tumores sólidos. Los receptores de PDGF, particularmente PDGF-ß, participan en la regulaci ón de la PLI. Cuando un tumor entra en un estado hiperproliferativo, el oxígeno que suministra la sangre y otros nutrientes no pueden continuar con las demandas del tumor y resulta un estado de hipoxia. La hipoxia desencadena una cambio angiogénico que regula por incremento la expresión de varios factores, que incluyen VEGF y PDGF, que a su vez sirven parar iniciar la angiogénesis. Sin embargo, la angiogénesis que resulta forma una vasculatura tumor anormal. La vasculatura tumoral se altera hasta el punto que no puede drenar adecuadamente el exceso de líquido del intersticio y la acumulación de líquido hincha la matriz intersticial elástica causando un aumento en la presión. Si la presión supera la resistencia de la pared capilar, se produce compresión y aumenta la resistencia a la circulación sanguínea. [0012] Se ha sugerido esta propiedad de la mayoría de los tumores sólidos, la hipertensión intersticial tumoral o PLI elevada, como una posible diana por un esfuerzo por aumentar la captación de fármaco por el tumor (Jain y col., (1987) Cancer Res., 47:3039-3051). La PLI elevada actúa de barrera para el transporte transvascular (Jain y col. (1997), Adv. Drug Deliv. Rev. 26:71-90). Se ha mostrado que la reducción de PLI tumoral, o modulación de la presión microvascular, aumenta el transporte transvascular de anticuerpos que eligen tumor como diana o compuestos trazadores de bajo peso molecular (Pietras y col., (2001), Cancer Res., 61, 2929-2934). La etiología de la hipertensión intersticial en los tumores se entiende muy poco. Una teoría propuesta es que la falta de vasos linfáticos en los tumores es un factor contribuyente al aumento de la PLI tumoral (Jain y col., (1987), Cancer Res., 47:3039-3051). Otra teoría propuesta es que es probable que la microvasculatura y el compartimento de estroma de sostén sean importantes determinantes para la PLI tumoral (Pietras y col., (2002) Cancer Res., 62: 5476-5484). Cada vez hay más pruebas de la tirosina cinasa del receptor de PDGF ß transmembrana como una posible diana para agentes terapéuticos farmacológicos para modular la hipertensión intersticial tumoral. Entre otras posibles dianas están los factores de crecimiento que se unen al receptor... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero específico para PDGF que comprende la siguiente estructura: en la que indica un ligador Aptámero = 5'dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG (SEC ID Nº: 69) - PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA (SEC ID Nº: 40) - PEG - dTdGdAdTmCdCdTmGmGmG-3T-3' (SEC ID Nº: 70); en la que d denota un desoxi-nucleótido, m denota un 2'-OMe-nucleótido, PEG denota un espaciador de PEG y 3T denota una tapa de desoxi-timidina invertida. 2. El aptámero de la reivindicación 1, en el que el ligador es un ligador de alquilo. 3. El aptámero de la reivindicación 2, en el que el ligador de alquilo comprende 2 a 18 grupos CH2 consecutivos. 4. El aptámero de la reivindicación 2, en el que el ligador de alquilo comprende 2 a 12 grupos CH2 consecutivos. 5. El aptámero de la reivindicación 2, en el que el ligador de alquilo comprende 3 a 6 grupos CH2 consecutivos. 6. El aptámero de la reivindicación 5, en el que el aptámero comprende la siguiente estructura: en la que Aptámero = 5'dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG (SEC ID Nº: 69) - PEG - dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA (SEC ID Nº: 40) - PEG - dTdGdATmCdCdTmGmGmG-3T-3' (SEC ID Nº: 70); en la que d denota un desoxi-nucleótido, m denota un 2'-OMe-nucleótido, PEG denota un espaciador de PEG y 3T denota una tapa de desoxi-timidina invertida. 7. Un aptámero según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el espaciador es un espaciador de PEG 6. 8. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una sal del mismo. 9. La composición de la reivindicación 8, en la que la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. 10. Una composición según la reivindicación 9 para su uso en un procedimiento para tratar un tumor sólido, procedimiento que comprende administrar la composición a un sujeto que tiene el tumor sólido. 11. La composición para su uso según la reivindicación 10, comprendiendo el procedimiento de tratar un tumor sólido además administrar al sujeto un agente citotóxico. 12. Un aptámero específico para PDGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un procedimiento para tratar un tumor mediado por PDGF en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar el aptámero específico para PDGF al sujeto y tratar el sujeto con radioterapia. 118   119     121   122   123   124     126   127   128   129     131   132   133   134     136   137   138   139     141   142   143   144     146   147   148   149     151   152   153   154     156   157   158   159     161   162   163   164     166   167   168   169     171   172   173   174