Línea celular de hibridoma 3-631-436 que tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476.

Anticuerpos para el BNP humano específico del anillo

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con anticuerpos que reconocen epítopos únicos del BNP humano, con métodos para producir dichos anticuerpos y con inmunoensayos para el BNP humano que emplean dichos anticuerpos.

Antecedentes de la invención

El péptido natriurético atrial (al que se hará referencia aquí a partir de ahora como "ANP") , el péptido natriurético cerebral (al que se hará referencia aquí a partir de ahora como "BNP") , el péptido natriurético de tipo C (al que se hará referencia aquí a partir de ahora como "CNP") y el péptido natriurético de Dendroaspis (al que se hará referencia aquí a partir de ahora como "DNP") son cada uno miembros de una familia de hormonas conocidas como "péptidos natriuréticos". El ANP y el BNP comparten un amplio espectro de propiedades biológicas y pertenecen al sistema natriurético cardíaco. Tanto el ANP como el BNP tienen su origen en las células del miocardio, mientras que el CNP tiene su origen en las células endoteliales. El DNP fue aislado del veneno de la serpiente mamba verde y posee similitud estructural con ANP, BNP y CNP.

El BNP recibió su nombre por ser aislado por vez primera del cerebro porcino, por lo que "BNP" quedó como las siglas para "brain natriuretic peptide". Sin embargo, dado que el BNP pertenece al sistema natriurético cardíaco, se ha cambiado "cerebral (brain) " a "tipo B". Por lo tanto, "BNP" se refiere ahora a "péptido natriurético de tipo B".

El ANP es segregado por el corazón en la aurícula. El BNP es segregado por el corazón a través del seno coronario, predominantemente por los ventrículos cardíacos. El BNP es segregado como un precursor polipeptídico de 108 aminoácidos (véase Valli et al., J. Lab. Clin. Med., 134 (5) : 437-444 (Noviembre de 1999) ) . La forma madura del BNP está constituida por 32 aminoácidos (que representan los aminoácidos 77-108 del precursor polipeptídico de 108 aminoácidos) , con un anillo de 17 aminoácidos cerrado por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína, una cola aminoterminal de 9 aminoácidos y una cola carboxiloterminal de 6 aminoácidos. El ANP y el CNP tienen también un anillo de 17 aminoácidos cerrado por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína. Once de los diecisiete aminoácidos del anillo se conservan entre las tres moléculas. Además de la estructura de anillo de 17 aminoácidos, el ANP tiene una cola aminoterminal de 6 aminoácidos y una cola carboxiterminal de 5 aminoácidos. El ANP se produce como una forma pro-ANP de 126 aminoácidos, que es la forma de almacenamiento principal de ANP. Tras escisión proteolítica entre los aminoácidos 98 y 99, el péptido ANP maduro de 28 aminoácidos se encuentra en el plasma del seno coronario (véase Yandle, J. Internal Med., 235: 561-576 (1994) ) .

El CNP se encuentra en el cerebro y en el líquido cerebroespinal y es el más prevalente de los tres péptidos en el sistema nervioso central. Hay poca presencia, si es que llega a haberla, de CNP en el corazón. El Pro-CNP es un péptido de 103 aminoácidos que se procesa a CNP-53 (aminoácidos 51 a 103) o a CNP-22 (aminoácidos 82 a 103) , que son los péptidos activos. Además de la estructura de anillo de 17 aminoácidos, el CNP-22 tiene una cola aminoterminal de 5 aminoácidos y no contiene cola carboxiterminal. El CNP-53 es idéntico al CNP-22, excepto por una extensión de 31 aminoácidos en el extremo aminoterminal.

Como se ha mencionado anteriormente, el DNP fue aislado del veneno de la serpiente mamba verde. La forma madura del DNP está constituida por 38 aminoácidos. Se ha descrito inmunorreactividad de tipo DNP (DNP-LI) en el plasma humano y se ha visto que la concentración plasmática de DNP-LI está elevada en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (véase Cataliotti et al., Mayo Clin. Proc., 76: 111-1119 (2001) ) . Adicionalmente, también se sabe que la infusión de DNP sintético da lugar a natriuresis y diuresis marcadas en asociación con un aumento de monofosfato cíclico de guanosina plasmático y urinario. Id.

Uno de los problemas de los péptidos natriuréticos humanos naturales es que son inestables en plasma y suero. Concretamente, las enzimas, tales como las proteasas, escinden estos péptidos. Por ejemplo, las proteasas escinden el BNP (natural y sintético) en diversas localizaciones a lo largo de su cadena de aminoácidos. Por ejemplo, se sabe que la escisión por proteasas ocurre en el extremo amino del BNP entre los aminoácidos 2-3 (Shimizu et al., Clinica Chimica Acta, 316: 129-135 (2002) ) y en su extremo carboxi entre los aminoácidos 30-32. Más aún, también se conoce en la técnica la escisión por endopeptidasas del BNP (Davidson y Struthers, J. Hypertension, 12: 329-336 (1994) ) .

Se ha visto que la medición del BNP maduro (es decir, la molécula de 32 aminoácidos (aminoácidos 77-108 del polipéptido precursor del BNP) ) en humanos (al que en adelante se hará aquí referencia como "Hbnp") en la población general refleja enfermedades cardíacas, tales como la insuficiencia cardíaca congestiva, las enfermedades cardíacas isquémicas, la fibrilación auricular y la disfunción renal. De hecho, se han descrito niveles elevados de BNP en el plasma humano en enfermedades cardíacas, tras un infarto agudo de miocardio y durante una disfunción ventricular asintomática o subclínica (véanse Mukoyama et al., J. Clin. Invest., 87: 11402-11412 (1991) ; Motwani et al., Lancet, 341: 1109-1113 (1993) ; Yoshibayashi et al., New Eng. J. Med., 327: 434 (1992) ) . Se observan niveles circulantes aumentados de ANP en la insuficiencia cardíaca congestiva, la insuficiencia renal crónica y la hipertensión severa. La presencia de CNP en el plasma humano sigue siendo controvertida, con informes sobre su ausencia o presencia como CNP-22 (véase Yandle, J. Internal Med., 235: 561-576 (1994) ) .

Un ensayo de unión a ligandos es una técnica analítica para medir concentraciones de substancias a las que comúnmente se hace referencia como ligandos y que reaccionan selectivamente con proteínas de unión específicas. Los inmunoensayos que miden las concentraciones de antígenos que reaccionan selectivamente con anticuerpos específicos son un ejemplo de una clase de ensayos de unión a ligandos.

Los ensayos de unión a ligandos, tales como los inmunoensayos, para medir péptidos natriuréticos humanos en plasma, en particular el Hbnp, son bien conocidos en la técnica y tienen disponibilidad comercial. Estos inmunoensayos requieren el uso de al menos uno o dos anticuerpos específicos, así como de al menos un calibrador y, de forma ideal, de al menos un control. Además de los calibradores y controles, los inmunoensayos requieren el uso de al menos una muestra de ensayo. Las muestras de ensayo son normalmente muestras biológicas derivadas de suero, plasma, sangre entera u otros fluidos corporales (normalmente de un paciente humano) . Se cuantifican los niveles de al menos un péptido natriurético humano en la muestra de ensayo en el inmunoensayo.

Por ejemplo, la Patente EE.UU. Nº 6.162.902 (a la que en adelante se hará aquí referencia como la "patente '902 ") describe anticuerpos aislados que son monoespecíficamente reactivos con los epítopos 1-10, 5-13 y 15-25 del Hbnp. Más en particular, la patente '902 describe dos anticuerpos monoclonales aislados. El primer anticuerpo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 106.3 (Nº de Acceso ATCC HB 12044) y es monoespecíficamente reactivo con los epítopos 5-13 del Hbnp. El segundo anticuerpo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 201.3 (Nº de Acceso ATCC HB 12045) y es monoespecíficamente reactivo con los epítopos 1-10 del Hbnp. La patente '902 también describe el uso de los anteriores anticuerpos en inmunoensayos con el fin de cuantificar la cantidad de Hbnp en una muestra biológica. La Patente EE.UU. Nº 6.677.124 (a la que en adelante se hará aquí referencia como la "patente ' 124") describe un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos LYS-VAL-LEU-ARG-ARG-HIS, que se encuentra en la región C-terminal del Hbnp, a saber, los epítopos 27-32. Más en particular, la patente '124 describe un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma BC203 (FERM BP-3515) . La patente '124 también describe inmunoensayos para Hbnp que utilizan este anticuerpo monoclonal.

Como se ha mencionado brevemente con anterioridad, uno de los problemas de los péptidos natriuréticos humanos naturales es que estos péptidos son inestables en plasma... [Seguir leyendo]

1. Línea celular de hibridoma 3-631-436 que tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476.

2. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476.

3. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento del Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo con una muestra de ensayo sospechosa de contener o que se sabe contiene Hbnp o un fragmento de Hbnp para formar un complejo anticuerpo-Hbnp, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP es producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso

A.T.C.C. PTA-6476, y

(b) detección de la formación del complejo anticuerpo-Hbnp.

4. El inmunoensayo de la reivindicación 3, donde el inmunoensayo incluye además el contacto del complejo anticuerpo-Hbnp con al menos un anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo para formar un complejo anticuerpo de captura-Hbnp-anticuerpo de detección, donde dicho anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo está conjugado con un marcaje detectable.

5. El inmunoensayo de la reivindicación 4, donde el inmunoensayo relaciona la cantidad del complejo anticuerpoHbnp-anticuerpo de detección formado con la cantidad del Hbnp o fragmento de Hbnp mediante el uso de una curva estándar para el Hbnp o el fragmento del Hbnp.

6. El inmunoensayo de la reivindicación 3, donde el inmunoensayo incluye además un péptido Hbnp marcado, un fragmento de Hbnp marcado o un análogo de Hbnp marcado que se une al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo.

7. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento del Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo que se une al Hbnp con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp para formar un complejo anticuerpo de captura-Hbnp, donde el al menos un anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476;

(b) contacto de dicho complejo anticuerpo de captura-Hbnp con al menos un anticuerpo de detección o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo para formar un complejo anticuerpo de captura-Hbnpanticuerpo de detección, donde dicho anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo está conjugado con un marcaje detectable y, además, donde dicho anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo se une específicamente a un epítopo peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene los aminoácidos 5-13 del Hbnp;

(c) determinación de la cantidad de complejos anticuerpo de captura-Hbnp-anticuerpo de detección formados en la etapa (b) ; y

(d) relación de la cantidad de los complejos anticuerpo de captura-Hbnp-anticuerpo de detección formados con la cantidad del Hbnp o fragmento de Hbnp mediante el uso de una curva estándar para el Hbnp o fragmento de Hbnp.

8. El inmunoensayo de la reivindicación 7, donde el anticuerpo de detección es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo.

9. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento del Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo que se une al Hbnp o a un fragmento de Hbnp con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp para formar un complejo anticuerpo de captura-Hbnp, donde el al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 106.3, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. HB 12044;

(b) contacto de dicho complejo anticuerpo de captura-Hbnp con al menos un anticuerpo de detección o

fragmento de unión a antígeno BNP del mismo para formar un complejo anticuerpo de captura-Hbnpanticuerpo de detección, donde dicho anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo está conjugado con un marcaje detectable y, además, donde dicho anticuerpo de detección o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476;

(c) determinación de la cantidad de complejos anticuerpo de captura-Hbnp-anticuerpo de detección formados en la etapa (b) ; y

(d) relación de la cantidad de los complejos anticuerpo de captura-Hbnp-anticuerpo de detección formados con la cantidad del Hbnp o fragmento de Hbnp mediante el uso de una curva estándar para el Hbnp o fragmento de Hbnp.

10. El inmunoensayo de la reivindicación 7 ó 9, que además incluye la etapa de inmovilización de al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo sobre una fase sólida para producir un primer anticuerpo inmovilizado antes de la etapa (a) .

11. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento del Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) inmovilización de al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo que se une a Hbnp o a un fragmento de Hbnp sobre una fase sólida para producir un primer anticuerpo inmovilizado, donde el al menos un anticuerpo de captura o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476;

(b) contacto de dicho anticuerpo de captura inmovilizado con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp para formar un complejo primer anticuerpo inmovilizado-Hbnp;

(c) contacto de dicho anticuerpo de captura inmovilizado con un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp que ha sido conjugado con un marcaje detectable para formar un segundo complejo anticuerpo inmovilizado-Hbnp, y, además, donde el fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 13-20, 13-19, 13- 18, 13-17, 13-16, 13-15, 1420, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 16-20, 16-19 ó 16-18 del Hbnp;

(d) determinación de la cantidad de marcaje detectable en los segundos complejos anticuerpo inmovilizado-Hbnp formados en la etapa (c) ; y

(e) relación de la cantidad de los complejos segundo anticuerpo-Hbnp-anticuerpo formados con la cantidad del Hbnp o del fragmento de Hbnp mediante el uso de una curva estándar para el Hbnp o el fragmento de Hbnp.

12. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento del Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) inmovilización de un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp sobre una fase sólida para producir un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp inmovilizado, donde el fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp tiene una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 13-20, 1319, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 14-20, 14-19, 14-18, 14- 17, 14-16, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 16-20, 1619 ó 16-18 del Hbnp;

(b) contacto de dicho péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp inmovilizado con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp;

(c) contacto de dicho péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp inmovilizado y de la muestra de ensayo sospechosa de contener BNP o un fragmento de Hbnp con al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo que se ha conjugado con un marcaje detectable para formar un complejo Hbnp inmovilizado-anticuerpo y un complejo Hbnp no inmovilizado-anticuerpo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476;

(d) eliminación del complejo Hbnp no inmovilizado-anticuerpo;

(e) determinación de la cantidad de complejo Hbnp inmovilizado-anticuerpo formado en la etapa (c) ; y

(f) relación de la cantidad del complejo Hbnp inmovilizado-anticuerpo formado con la cantidad del Hbnp o del fragmento de Hbnp mediante el uso de una curva estándar para el Hbnp o el fragmento de Hbnp.

13. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento de Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp para formar un complejo Hbnpanticuerpo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476;

(b) contacto de dicho complejo Hbnp-anticuerpo con un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp marcado, donde el fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp marcado tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los aminoácidos 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13- 16, 13-15, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 16-20, 16-19 ó 16-18 del Hbnp;

(c) determinación de la cantidad de complejo Hbnp marcado-anticuerpo formado; y

(d) relación de la cantidad del complejo Hbnp marcado-anticuerpo formado con la cantidad de Hbnp en la muestra mediante el uso de una curva estándar.

14. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento de Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo con una muestra de ensayo sospechosa de contener Hbnp o un fragmento de Hbnp y un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp

o análogo de Hbnp marcado para formar complejos Hbnp marcado-anticuerpo y complejos Hbnp no marcado-anticuerpo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476 y, además, donde el fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp marcado tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los aminoácidos 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 1520, 15-19, 15-18, 15-17, 16-20, 16-19 ó 16-18 del Hbnp;

(b) determinación de la cantidad de complejos Hbnp marcado-anticuerpo formados; y

(c) relación de la cantidad de los complejos Hbnp marcado-anticuerpo formados con la cantidad Hbnp mediante el uso de una curva estándar.

15. Un inmunoensayo para el BNP humano (Hbnp) o un fragmento de Hbnp, cuyo inmunoensayo comprende las etapas de:

(a) contacto de al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo con un péptido Hbnp, fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp marcado para formar un complejo Hbnp marcadoanticuerpo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno BNP del mismo producido por la línea celular de hibridoma 3-631-436, donde dicha línea celular tiene el Nº de Acceso A.T.C.C. PTA-6476 y, además, donde el fragmento de Hbnp o análogo de Hbnp marcado tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los aminoácidos 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 13-15, 14-20, 1.4-19, 14-18, 14-17, 14-16, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 16-20, 16-19 ó 16-18 del Hbnp;

(b) contacto de dicho complejo Hbnp marcado-anticuerpo con una muestra de ensayo sospechosa de contener BNP o un fragmento de Hbnp;

(c) determinación de la cantidad de complejo Hbnp marcado-anticuerpo formado; y

(d) relación de la cantidad del complejo Hbnp marcado-anticuerpo formado con la cantidad de Hbnp en la muestra mediante el uso de una curva estándar.