Anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo humano inhibidor del factor VIII,

siendo dirigido dicho anticuerpo inhibidor contra el dominio C1 del factor VIII, en el que la región variable de cada una de sus cadenas livianas está codificada por la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), y la región variable de cada una de sus cadenas pesadas está codificada por la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).

Anticuerpos anti-idiotípicos que neutralizan la actividad inhibidora de un anticuerpo inhibidor dirigido contra el dominio C1 del factor VIII.

Técnica anterior e introducción

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo inhibidor del factor VIII que se une al dominio C1 del factor VIII, así como a una línea celular que produce este anticuerpo monoclonal antiidiotípico, al uso de este anticuerpo monoclonal antiidiotípico como medicamento y, más particularmente, a su uso para fabricar un medicamento destinado al tratamiento de la hemofilia A.

La hemofilia A es una enfermedad hereditaria vinculada a una anomalía del cromosoma X, que se traduce en una incapacidad para coagular en las personas afectadas. Esta enfermedad es el resultado de mutaciones en el gen de una proteína que interviene en la coagulación, el factor VIII (FVIII) , que determinan una ausencia total de factor VIII en la sangre o un déficit parcial. La hemofilia A es la más común de las deficiencias que afectan la coagulación sanguínea: en Francia, afecta a 1 hombre de cada 5000, lo que representa un 80% de los pacientes afectados de hemofilia. El otro tipo de hemofilia, la hemofilia B, afecta al 20% de los pacientes afectados de hemofilia; su causa es la deficiencia en otro factor de coagulación, el factor IX.

El tratamiento actual de la hemofilia (de tipo A o B) consiste en administrar, por vía intravenosa, el factor de coagulación deficiente o faltante. En Francia, el factor VIII destinado al tratamiento de las hemofilias está disponible tanto en forma de medicamentos derivados de la sangre, suministrados por el Laboratorio Francés de Fraccionamiento y Biotecnologías (LFB) o por laboratorios farmacéuticos internacionales, como en forma de medicamentos recombinantes producidos por ingeniería genética. En efecto, el ADN que codifica para el factor VIII fue aislado y expresado en células de mamíferos (Wood et al., Nature (1984) 312: 330-337) , y su secuencia en aminoácidos deducida a partir del ADNc.

El factor VIII (FVIII) secretado es una glicoproteína de masa molecular de 300 Kda (2332 aminoácidos) que juega un papel clave en la activación de la vía intrínseca de la coagulación. El FVIII inactivo está constituido por seis dominios: A1 (residuos 1-372) , A2 (residuos 373-740) , B (residuos 741-1648) , A3 (residuos 1649-2019) , C1 (residuos 2020-2172) , y C2 (residuos 2173-2332) , del extremo N- terminal al extremo C-terminal. Tras la secreción, el FVIII interactúa con el factor von Willebrand (vWF) que lo protege de las proteasas plasmáticas. El FVIII se disocia del vWF que es separado por la trombina. Esta separación logra que se elimine el dominio B y se forme un heterodímero. Con esta forma, el FVIII circula en el plasma. Este heterodímero está compuesto por una cadena pesada (A1, A2) y por una cadena liviana (A3, C1, C2) .

Cuando se infunde en un paciente hemofílico, el factor VIII se fija al factor von Willebrand en la circulación sanguínea del paciente. El factor VIII activado actúa como cofactor del factor IX activado, acelerando la conversión del factor X en factor X activado. El factor X activado convierte la protrombina en trombina. La trombina convierte el fibrinógeno en fibrina y se forma un coágulo.

El principal problema que plantea la administración de factor VIII es que aparecen, en el paciente, anticuerpos dirigidos contra el factor VIII, llamados “anticuerpos inhibidores”. Estos anticuerpos neutralizan la actividad procoagulante del factor VIII, que se vuelve inactivo apenas se infunde. En consecuencia, el factor de coagulación administrado se destruye antes de haber podido detener la hemorragia, lo que representa una complicación grave de la hemofilia, en virtud de la ineficacia del tratamiento. Además, algunos pacientes no hemofílicos genéticamente pueden desarrollar inhibidores contra el factor VIII endógeno: se trata de una hemofilia adquirida.

Estudios demostraron que la respuesta inmune anti-factor VIII es de tipo IgG policlonal que pertenece, principalmente, a la subclase IgG4 e IgG1 y, menos frecuentemente, IgG2. Las IgG3 no se representan nunca. La cadena liviana suele ser de tipo Kappa. La sobrerrepresentación de las IgG4 es más acentuada en los hemofílicos que tienen un inhibidor instalado desde hace mucho tiempo. Los dominios C2 y A2 de la molécula de FVIII son los blancos privilegiados de la respuesta inmune aunque, en algunos casos, se detectan anticuerpos dirigidos contra el dominio A3. Al pasar el plasma de pacientes hemofílicos a través de una columna de inmunoadsorción en la que se inmoviliza el FVIII, se pueden purificar los anticuerpos totales anti-FVIII. Las cantidades recogidas suelen superar 100ig por 10mg de IgG totales (Gilles JG et al. (1993) Blood; 82: 2452-2461) . Se desarrolló un modelo animal para estudiar la formación de inhibidores del factor VIII; ratas inmunizadas con factor VIII humano recombinante muestran una respuesta inmune rápida, de tipo policlonal (Jarvis et al. Thromb Haemost. 1996 Feb; 75 (2) :318-25) . Los mecanismos por los cuales los anticuerpos anti-factor VIII interfieren con la función del factor VIII son numerosos e incluyen la interferencia en la proteólisis del factor VIII y en la interacción del factor VIII con diferentes asociados como el factor Von Willebrand (vWF) , los fosfolípidos (FL) , el factor IX, el factor X activado (FXa) o la APC (Activated Protein C) . Hay muchos tratamientos que permiten atenuar las consecuencias de esta respuesta inmune, por ejemplo, los tratamientos que involucran la desmopresina, una hormona sintética que estimula la producción de factor VIII, los agentes promotores de la coagulación, como los concentrados de complejos protrombínicos o los concentrados de complejos protrombínicos activados, el factor VIIa recombinante, la plasmaféresis y las infusiones de cantidades importantes o intermedias de factor VIII. No obstante, estos métodos son muy costosos y poco eficaces.

Debido a la complejidad de analizar in vivo esta respuesta inmune policlonal, se aislaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra algunos dominios del factor VIII. Así, se aisló un anticuerpo humano monoclonal de tipo IgG4kappa, LE2E9. Este anticuerpo se dirige contra el dominio C1 del factor VIII e inhibe la actividad cofactor del factor VIII y su unión con el factor Von Willebrand (Jacquemin et al. (2000) Blood 95:156-163) . Del mismo modo, se aisló un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el dominio C2 del factor VIII, llamado BO2C11 (IgG4kappa) producido a partir de un repertorio de células de memoria B de un paciente afectado de hemofilia A con inhibidores (Jacquemin et al. Blood 1998 JuI 15;92 (2) :496-506) . BO2C11 reconoce el dominio C2 del factor VIII e inhibe su unión con el factor Von Willebrand y los fosfolípidos. Inhibe totalmente la actividad procoagulante del factor VIII nativo y activado. Otro ejemplo de anticuerpo monoclonal es el anticuerpo BOIIB2, dirigido contra el dominio A2 del factor VIII. El anticuerpo BOIIB2 inhibe la actividad del factor VIII en un 99%. Al unirse al domino A2, puede interferir e inhibir la fijación del FIXa que posee un sitio de fijación de poca afinidad en esta región del FVIII y, por consiguiente, inhibir la actividad enzimática del FIXa. El segundo modo de acción que puede considerarse es su interferencia en el equilibrio entre la forma heterodimérica (A2:A1 y A3:C1:C2) del FVIII y la forma heterotrimérica (A2 y A1 y A3:C1:C2) del FVIII acelerando la disociación del dominio A2 de estos complejos, volviéndolos no funcionales. (Ananyeva NM et al (2004) Blood Coagul Fibrinolysis. Mar;15 (2) :109-24. Review) . Gracias a estas nuevas herramientas, otra estrategia de lucha contra los anticuerpos inhibidores del factor VIII, más reciente, considera la administración de anticuerpos antiidiotípicos (anticuerpos que tienen la capacidad de interactuar con la región variable de otros anticuerpos) que neutralizan los anticuerpos inhibidores (Saint-Rémy JM et al. (1999) Vox Sang; 77 (suppl 1) : 21-24) . Un anticuerpo antiidiotípico murino, el 14C12, descrito en el documento WO 2004/014955, neutraliza, in vivo, de modo dosis-dependiente, las propiedades inhibidoras del anticuerpo antifactor VIII diana (el anticuerpo monoclonal BO2C11) , que se dirige contra el dominio C2 del factor VIII. Como la respuesta inmune anti-factor VIII es policlonal, también se desarrollaron (y se describieron en el documento FR 05 08320) los anticuerpos antiidiotípicos murinos dirigidos contra el dominio A2 del factor VIII. El dominio A2 es un dominio de 43 kD cuya función no se conoce mucho, pero se demostró que los anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo humano inhibidor del factor VIII, siendo dirigido dicho anticuerpo inhibidor contra el dominio C1 del factor VIII, en el que la región variable de cada una de sus cadenas livianas está codificada por la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , y la región variable de cada una de sus cadenas pesadas está codificada por la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .

2. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según la reivindicación 1, en el que la secuencia peptídica de la región variable de cada una de sus cadenas livianas es la secuencia de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) , y la secuencia peptídica de la región variable de cada una de sus cadenas pesadas es la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo producido por la hibridoma 18B6, depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .

3. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el anticuerpo inhibidor es el anticuerpo RHD5 (depositado en la colección BCCM/LMBP con el número LMBP 6165CB) .

4. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque es un anticuerpo murino o un anticuerpo quimérico, particularmente un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo humanizado.

5. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según la reivindicación 4, caracterizado porque es una IgG1kappa.

6. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se trata de un fragmento f (ab) 2, de un fragmento Fab', de un fragmento Fab.

7. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está producido por la hibridoma 18B6 depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .

8. Línea celular estable que produce un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la cepa celular se elige dentro del grupo que consiste en: SP2/0, YB2/0, IR983F, el mieloma humano Namalwa, PERC6, las líneas CHO, particularmente CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7.

29. HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653.

9. Hibridoma 18B6 depositada con el número de registro CNCM I-3559 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .

10. Composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacéuticamente aceptables.

11. Composición según la reivindicación 12, caracterizada porque además comprende un anticuerpo monoclonal antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo anti-FVIII dirigido contra un dominio distinto al dominio C1 del factor VIII, particularmente un anticuerpo antiidiotípico dirigido contra un anticuerpo anti-FVIII dirigido contra el dominio C2 del factor VIII y/o un anticuerpo dirigido contra el dominio A2 del factor VIII.

12. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la hemofilia de tipo A, particularmente una hemofilia de tipo A con inhibidores.

13. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para neutralizar in vitro la actividad inhibidora de un anticuerpo inhibidor dirigido contra el dominio C1 del factor VIII.

14. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la detección y/o la purificación in vitro de anticuerpos inhibidores del factor VIII.