ANTICUERPO MONCLONAL QUE RECONOCE LA PROTEÍNA GAPDH DE CANDIDA FAMATA.

Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína GAPDH de Candida famata.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº de acceso ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Gandida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo.

Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína GAPDH de Candida famata.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº de acceso ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos de hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo.

Estado de la técnica anterior El diagnóstico temprano de la candidiasis invasiva es extremadamente difícil ya que los síntomas no son específicos, lo que conduce a un retraso en la aplicación de una terapia adecuada (Laín et al., 2008. Clin. Dev. Immunol., 2008: art. ID 721950.) . Esto ha impulsado el desarrollo de numerosas técnicas de diagnóstico, que pueden clasificarse como observación microscópica, métodos basados en cultivos microbiológicos y métodos independientes de cultivo (White et al., 2005. J. Clin. Microbiol., 43: 2181-2187) .

La observación microscópica puede aportar, en algunos casos, un diagnóstico tentativo, ya que la presencia de determinadas estructuras puede asociarse con ciertos géneros o especies. Sin embargo, aunque es una técnica rápida, pueden confundirse elementos fúngicos con componentes celulares del propio paciente, dando lugar a falsos positivos. Asimismo, presenta el inconveniente de que, en ocasiones, se requieren procedimientos invasivos que no pueden realizarse sin suponer un riesgo para el paciente (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother., 49 [suppl.S1]: 11-19) .

Otras técnicas microbiológicas tradicionales son los cultivos sanguíneos, que producen frecuentemente falsos negativos (Yeo y Wong, 2002. Clin. Microbiol. Rev., 15: 465-484) . Una vez que el organismo es aislado, la identificación puede tardar entre días y semanas, debido al lento crecimiento de los hongos. Debido a estos inconvenientes, se han desarrollado diferentes métodos independientes de cultivo, que se distinguen en función de que estén basados en identificación molecular, detección de componentes no antigénicos ó localización de anticuerpos y antígenos (Stevens, 2002. J. Antimicrob. Chemother., 49 [suppl.S1]: 11-19) . Para aumentar la velocidad, sensibilidad y especificidad del diagnóstico, están siendo utilizados métodos moleculares basados en la PCR que permiten la detección y amplificación del DNA fúngico presente en las muestras (Weig y Brown, 2007. Trends Microbiol., 15: 310-317) . Sin embargo, su alta sensibilidad puede plantear problemas al obtener falsos positivos asociados con la contaminación de la muestra. Para la detección de componentes no antigénicos en la sangre se han descrito como marcadores de infección el D-arabinitol yel β-1, 3-D-glucano. El D-arabinitol es un metabolito producido por ciertas especies de Candida, no encontrándose hasta el momento C. famata entre ellas. Por su parte el β-1, 3-D-glucano es un constituyente de la pared celular de levaduras y hongos filamentosos. Sin embargo, ambos métodos pueden generar falsos positivos. En el caso del Darabinitol en pacientes con insuficiencia renal y en el de β-1, 3-D-glucano en individuos sometidos a hemodiálisis o a determinados tratamientos terapéuticos (Gadea et al., 2007. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 25: 336-340) .

Por otra parte, la detección de anticuerpos en pacientes con candidiasis suele tener utilidad limitada, ya que no distingue entre colonización e infección (Gadea et al., 2007. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 25: 336-340) y suele tener resultados negativos cuando la sangre es recogida en las primeras fases de la infección, antes de la activación de la respuesta humoral. Además, los individuos inmunodeprimidos no generan cantidades detectables de anticuerpos, incluso cuando presentan candidiasis sistémicas (Shoham y Levitz, 2005. Br J Haematol., 129: 569-582) . Por este motivo se han intentado desarrollar inmunoensayos para detectar antígenos de C. albicans en el suero de individuos infectados (Laín et al., 2008. Clin. Dev. Immunol., 2008: art. ID 721950.) . Sin embargo, ninguno de ellos ha resultado suficientemente predictivo como para recomendarlo en una rutina de laboratorio clínico.

Otra de las patologías que podrían estar causadas por alguna especie de Candida, como por ejemplo Candida famata, es el AZOOR (Acute Zonal Occult Outer Retionopathy) . Este término ha sido propuesto recientemente para describir un grupo heterogéneo de retinopatías de etiología desconocida, cada una de las cuales tiene su propia identidad clínica, pudiendo coincidir en el mismo paciente o ser formas transicionales de una misma enfermedad. Este síndrome se caracteriza por la pérdida aguda en una o más zonas de la función retinal externa, fotopsias en algunos casos, cambios mínimos en el fondo de ojo, que suelen implicar el estrechamiento de los vasos sanguíneos y palidez

o incluso color blanquecino alrededor de la papila. Carrasco et al (Carrasco et al, 2005. J. Clin. Microbiol., 43: 635640) abren la posibilidad a que Candida famata pueda ser la causa de AZOOR.

Por tanto, sería muy útil el desarrollo de un método que fuese capaz de detectar y/o cuantificar microorganismos causantes de candidiasis u otras patologías causadas por infección por candidas patógenas, como por ejemplo AZOOR, con alta sensibilidad, fiabilidad y rapidez.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido del hibridoma depositado con nº ECACC09042201. Dicho anticuerpo es capaz de reconocer la proteína GAPDH de Candida famata. Asimismo, la presente invención se refiere a dicho hibridoma, al epítopo de la proteína GAPDH de Candida famata reconocido por dicho anticuerpo monoclonal, a los usos del hibridoma, anticuerpo o epítopo, o al kit que los comprende. Además, la presente invención se refiere a un método para la detección de Candida famata o para la determinación de la evolución de candidiasis producida por dicho microorganismo, así como al uso de los anticuerpos monoclonales de la presente invención con fines terapéuticos o para diagnóstico por imagen de candidiasis.

La selección del hibridoma de la presente invención, capaz de producir los anticuerpos que reconocen la proteína GAPDH, no es obvia a tenor de los resultados que se han obtenido y que se muestran en el apartado de ejemplos de la presente invención. El hibridoma depositado con nº ECACC09042201 produce una señal destacada en la detección de anticuerpos en comparación con el resto de hibridomas ensayados, lo que supone un efecto sorprendente y demuestra que la selección no es obvia. Otro efecto sorprendente se refiere a la especificidad de dicho anticuerpo para la especie de Candida famata de entre diversas especies ensayadas del género Candida. La detección específica del antígeno en extractos proteicos derivados de cultivos celulares se muestra efectiva tanto en condiciones desnaturalizantes como en condiciones no desnaturalizantes.

El hibridoma obtenido se depositó en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) , con fecha 22 de Abril de 2009 y con la referencia de depósito 09042201. La dirección de la Autoridad Internacional de Depósito ECACC es: Health Protection Agency/Centre for Emergency Preparedness and Response Porton Down/Salisbur y /SP4 0JG/UK.

Un aspecto de la presente invención se refiere a una célula del hibridoma depositado con nº 09042201 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) . En adelante puede emplearse el término "hibridoma ECACC09042201" para hacer referencia a una o más células de dicho hibridoma depositado. Un hibridoma es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito productor del anticuerpo específico de interés, con una línea celular de mieloma. Los hibridomas obtenidos después de fusionar células del bazo de ratones BALB/c, inmunizados con proteínas extracelulares producidas por Candida famata, con células de mieloma (X63.Ag.653 NP3) , se han ensayado mediante ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y se ha seleccionado el hibridoma ECACC09042201 que produce una señal destacada en la detección de anticuerpos contra alguna de las proteínas del extracto, de forma sorprendente, en comparación con el resto de hibridomas ensayados.

El hibridoma de... [Seguir leyendo]

1. Célula del hibridoma depositado con nº ECACC09042201.

2. Anticuerpo monoclonal, o cualquiera de sus fragmentos, obtenido de la célula del hibridoma según la reivindicación 1, que reconoce la proteína de Candida famata SEQ ID NO: 1, o cualquiera de sus variantes.

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, que reconoce una secuencia aminoacídica de dicha proteína de Candida famata que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

4. Antisuero aislado que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones2ó3.

5. Epítopo de la secuencia aminoacídica de Candida famata SEQ ID NO: 1, reconocido por el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.

6. Epítopo según la reivindicación 5 que se selecciona de la lista de secuencias que comprende SEQ ID NO: 2 a 10, o cualquiera de sus fragmentos.

7. Método para la detección y/o cuantificación de Candida famata que comprende:

a. obtener el extracto soluble de una muestra biológica aislada,

b. añadir el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, al extracto soluble del apartado (a) y

c. detectar y/o cuantificar el anticuerpo monoclonal añadido en el apartado (b) que esté unido al epítopo según cualquiera de las reivindicaciones5ó6.

8. Método para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata que comprende:

a. Determinar, según el método de la reivindicación 7, una primera concentración de Candida famata en una muestra biológica aislada de un individuo,

b. determinar una segunda concentración de Candida famata en otra muestra biológica del individuo del apartado (a) , y

c. comparar la segunda concentración obtenida en el apartado (b) con la primera concentración obtenida en el apartado (a) para determinar si hay o no alguna diferencia significativa.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde la muestra biológica aislada es un fluido biológico.

10. Método según la reivindicación 9, donde el fluido biológico es suero sanguíneo.

11. Uso del hibridoma según la reivindicación 1 para la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones2ó3.

12. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la detección de Candida famata.

13. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata.

14. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones2ó3 para detectar, cuantificar, aislar o purificar el antígeno que reconoce dicho anticuerpo.

15. Uso del epítopo según cualquiera de las reivindicaciones5ó6 para la generación de cualquier anticuerpo.

16. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2ó3.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, donde el anticuerpo monoclonal está conjugado a un agente antifúngico.

18. Composición farmacéutica que comprende el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones5ó6.

19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 que además incluye excipientes farmacéuticamente aceptables.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 que además incluye otra sustancia activa.

21. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones2ó3 para su uso como medicamento.

22. Epítopo según cualquiera de las reivindicaciones5ó6 para su uso como medicamento.

23. Uso del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

24. Uso del epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de candidiasis producida por Candida famata.

25. Kit que comprende la célula del hibridoma según la reivindicación 1.

26. Uso del kit según la reivindicación 25 para la producción del anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones2ó3.

27. Kit que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones2ó3.

28. Uso del kit según la reivindicación 27 para la detección de Candida famata.

29. Uso del kit según la reivindicación 27 para la determinación de la evolución de candidiasis producida por Candida famata.

30. Kit que comprende el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones5ó6.

31. Uso del kit según la reivindicación 30 para la generación de cualquier anticuerpo.

32. Kit que comprende la célula del hibridoma según la reivindicación 1, el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, el epítopo según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, o cualquiera de sus combinaciones.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad Autónoma de Madrid (70%) Consejo Superior de investigaciones Científicas (CSIC) (30%)

<120> Anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína GAPDH de Candida famata <130> 1595.3bis <160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 6

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 8

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 9

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> Debar y omyces hansenii <400> 10

<210> 11

<211> 335

<212> PRT

<213> Candida albicans <400> 11

<210> 12

<211> 332

<212> PRT

<213> Candida glabrata <400> 12 <210> 13

<211> 332

<212> PRT

<213> Candida glabrata <400> 13