Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que posee una secuencia:

Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (ID DE SECUENCIA Nº: 26);

en la que:

Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ó un dipéptido Gly-Ile;

Xaa2 es Trp ó un análogo de Trp, donde el análogo de Trp posee un carácter hidrófobo incrementado en comparación con Trp y se selecciona de entre un triptófano halogenado, 5-metoxitriptófano, 5-metiltriptófano y 1-metiltriptófano, con la condición de que, si Xaa3 es Trp, Xaa2 sea el análogo de Trp;

Xaa3 es Trp ó un análogo de Trp que posee un hidrógeno del indol sustituido por un átomo de flúor, incrementando así el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol;

Xaa4 es His, Ala, Phe ó Trp;

Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido Thr-Asn ó Thr-Ala, ó un tripéptido Thr-Ala-Asn, donde un -OH carboxi-terminal de cualquiera de entre L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly ó Asn es sustituido de forma opcional por -NH2; y

los dos residuos de Cys están unidos mediante un enlace disulfúrico.

Análogos potentes de la compstatina.

La presente invención hace referencia a la activación de la cascada del complemento en el cuerpo. En particular, esta invención proporciona péptidos y peptidomiméticos capaces de unirse a la proteína C3 e inhibir la activación del complemento.

El sistema del complemento es la primera línea de defensa inmunológica contra los patógenos externos. Su activación a través de la vía clásica, alternativa o de las lectinas conduce a la generación de los péptidos anafilatóxicos C3a y C5a y a la formación del complejo de ataque a membrana C5b-9. El componente del complemento C3 desempeña un papel fundamental en la activación de las tres vías. La activación de C3 mediante convertasas de C3 de la vía del complemento y su posterior acoplamiento a la superficie objetivo conduce a la formación del complejo de ataque a membrana y a la larga a daños en o lisis en las células objetivo. C3 es único en que posee una rica arquitectura que proporciona una gran diversidad de sitios de unión a ligandos que son importantes en las vías de la supervisión inmunológica y de la respuesta inmunitaria.

La activación inadecuada del complemento puede conducir a daños en la célula huésped. El complemento está involucrado en varios estados de enfermedades, incluyendo diversas enfermedades autoinmunes, y se ha descubierto que contribuye a otras condiciones clínicas tales como el síndrome respiratorio del adulto, los ataques al corazón, el rechazo después de un xenotransplante y las lesiones por quemaduras. También se ha descubierto que las lesiones tisulares con mediación del complemento son el resultado de situaciones de bioincompatibilidad tales como las que se encuentran en los pacientes que se someten a diálisis o bypass cardiopulmonar.

En las lesiones tisulares con mediación del complemento actúa de mediador directo el complejo de ataque a membrana, e indirecto la generación de C3a y C5a. Estos péptidos inducen daños a través de sus efectos en diferentes células, incluyendo los neutrófilos y los mastocitos. In vivo, la regulación del complemento en los pasos de activación de C3 y C5 la proporcionan tanto las proteínas plasmáticas como las proteínas de membrana. Los inhibidores de las proteínas plasmáticas son el factor H y la proteína de unión a C4, y las proteínas de membrana reguladoras ubicadas en las superficies celulares son los receptores del complemento 1 (CR1) , el factor acelerador de la degradación (DAF) , y la proteína cofactor de membrana (MCP) . Estas proteínas inhiben las convertasas de C3 y C5 (proteasas con múltiples subunidades) , estimulando la disociación de los complejos con múltiples subunidades y/o inactivando los complejos a través de proteolisis (catalizados por el factor I) . Se han identificado diferentes agentes farmacológicos que regulan o modulan la actividad del complemento mediante ensayo in vitro, pero in vivo la mayoría han demostrado ser de baja actividad o tóxicos.

Hasta la fecha, no se ha aprobado ningún inhibidor de activación del complemento para su uso clínico, aunque existen algunos candidatos para el uso clínico, en concreto, una forma recombinante del receptor del complemento 1 conocida como receptor soluble del complemento 1 (sCR1) y un anticuerpo antiC5 monoclonal humanizado (5G1.1-scFv) . Estas dos sustancias se ha demostrado que suprimen la activación del complemento en modelos animales in vivo (Kalli KR et al., 1994; y, Wang et al., 1996) . Sin embargo, cada sustancia posee la desventaja de ser una proteína de gran peso molecular (240 kDa y 26 kDa, respectivamente) que es difícil de fabricar y debe administrarse mediante infusión. De acuerdo con esto, investigaciones recientes han hecho hincapié en el desarrollo de agentes activos más pequeños que sean más fáciles de administrar, más estables y menos costosos de fabricar.

La patente estadounidense nº 6.319.897 de Lambris et al. describe el uso de una biblioteca aleatoria combinatoria de péptidos expresados en fago para identificar un péptido de 27 residuos que se une a C3 e inhibe la activación del complemento. Este péptido se fragmentó en un segmento cíclico de 13 residuos que mantenía una actividad completa, lo que se denomina en la técnica compstatina. La compstatina inhibe la división de C3 en C3a y C3b mediante convertasas de C3. La compstatina ha sido sometida a ensayo en una serie de experimentos de interfaz in vitro, in vivo, ex vivo, y in vivo/ex vivo, y se ha demostrado que: (1) inhibe la activación del complemento en el suero humano (Sahu A et al., 1996) ; (2) inhibe la activación del complemento inducida por heparina/protamina en primates sin efectos secundarios significativos (Soulika AM et al., 2000) ; (3) prolonga la vida de un xenoinjerto porcino a ser humano perfundido con sangre humana (Fiane AE et al., 1999a; Fiane AE et al., 1999b; y, Fiane AE et al., 2000) ; (4) inhibe la activación del complemento en modelos de bypass cardiopulmonar, plasmaféresis, y circuitos extracorpóreos de diálisis (Nilsson B et al., 1998) ; y (5) posee una baja toxicidad (Furlong ST et al., 2000) .

La compstatina es un péptido que comprende la secuencia ICVVQDWGHHRCT-NH2 (ID DE SECUENCIA Nº: 1) , en la que Cys2 y Cys12 forman un puente disulfuro. Se determinó su estructura tridimensional utilizando espectroscopia NMR en 2D homonuclear en combinación con dos metodologías computacionales distintas restringidas experimentalmente. La primera metodología implicaba geometría de distancia, dinámica molecular e hibridación simulada (Morikis D et al., 1998; WO99/13899) y la segunda metodología implicaba optimización global (Klepeis et al., J. Computational Chem., 20: 1344-1370, 1999) . La estructura de la compstatina reveló una superficie molecular que comprende una zona polar y una zona no polar. La parte polar incluye un giro β de tipo I y la zona no polar incluye el puente disulfuro. Además, se sintetizaron una serie de análogos con sustituciones de alanina (un

barrido de alanina) y se sometieron a ensayo buscando actividad, lo que reveló que los cuatro residuos del giro β y

el puente disulfuro con el conjunto hidrófobo de alrededor juegan papeles importantes en la actividad inhibidora de la compstatina (Morikis et al., 1998; WO99/13899) .

Utilizando un ensayo de la actividad del complemento que comprende medir la lisis eritrocitaria con mediación de la vía alternativa, se medido la IC50 de la compstatina en 12 μM. Algunos de los análogos sometidos a ensayo previamente han demostrado tener una actividad equivalente a o mayor que la de la compstatina. La solicitud de patente internacional publicada nº W02004/026328 revela análogos y miméticos de la compstatina con variaciones en los extremos N y C, y en las posiciones 4 y 9, que impartían una actividad mejorada en el antes mencionado ensayo. Se ha informado de mejoras de hasta 99 veces más que la compstatina para ciertos análogos (véase también, Mallik et al., 2005) . El desarrollo de análogos o miméticos de la compstatina con incluso mayor actividad constituiría un avance significativo en la técnica.

Katragadda et al (2006) J. Med. Chem., 49 (15) , pp 4616-4622 describe que el efecto hidrófobo y los enlaces de hidrógeno explican la actividad mejorada del inhibidor del complemento, la compstatina. WO2007/044668 describe el uso de la compstatina y de análogos de la misma inhibidores del complemento para tratar y/o prevenir afecciones oculares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona análogos y miméticos del péptido inhibidor del complemento, la compstatina (HOOC-ICVVQDWGHHRCT-NH2; ID DE SECUENCIA Nº: 1) , que poseen una actividad inhibidora del complemento mejorada en comparación con la compstatina.

En un aspecto, la invención presenta un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido con la siguiente secuencia:

Xaa1 – Cys – Val – Xaa2 – Gln – Asp – Xaa3 – Gly – Xaa4 – His – Arg – Cys – Xaa5 (ID DE SECUENCIA Nº: 26) ; en la que: Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido Gly-Ile; Xaa2 es Trp o un análogo de Trp, donde el análogo de Trp posee un carácter hidrófobo incrementado en comparación con Trp y se ha seleccionado de entre un triptófano halogenado, 5-metoxitriptófano, 5metiltriptófano y 1-metiltriptófano, con la condición de que, si Xaa3 es Trp, Xaa2 sea el análogo de Trp; Xaa3 es Trp o un análogo de Trp que posee un hidrógeno del indol... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que posee una secuencia:

Xaa1 – Cys – Val – Xaa2 – Gln – Asp – Xaa3 – Gly – Xaa4 – His – Arg – Cys – Xaa5 (ID DE SECUENCIA Nº: 26) ;

en la que: Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ó un dipéptido Gly-Ile; Xaa2 es Trp ó un análogo de Trp, donde el análogo de Trp posee un carácter hidrófobo incrementado en comparación con Trp y se selecciona de entre un triptófano halogenado, 5-metoxitriptófano, 5metiltriptófano y 1-metiltriptófano, con la condición de que, si Xaa3 es Trp, Xaa2 sea el análogo de Trp; Xaa3 es Trp ó un análogo de Trp que posee un hidrógeno del indol sustituido por un átomo de flúor, incrementando así el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol; Xaa4 es His, Ala, Phe ó Trp; Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido Thr-Asn ó Thr-Ala, ó un tripéptido Thr-Ala-Asn, donde un – OH carboxi-terminal de cualquiera de entre L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly ó Asn es sustituido de forma opcional por –NH2; y

los dos residuos de Cys están unidos mediante un enlace disulfúrico.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el análogo de Trp de Xaa2 es 5-fluoro-/-triptófano ó 6-fluoro-/triptófano.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el análogo de Trp de Xaa2 es 5-metoxitriptófano ó 5-metiltriptófano.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el análogo de Trp de Xaa2 es 1-metiltriptófano.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Xaa4 es Ala.

6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Xaa2 es 1-metil triptófano, Xaa3 opcionalmente es un análogo de Trp que posee un hidrógeno del indol sustituido por un átomo de flúor y Xaa4 es Ala.

7. El compuesto de la reivindicación 6, en el que el análogo de Trp opcional de Xaa3 es 5-fluoro-1-triptófano.

8. El compuesto de la reivindicación 1, que comprende cualquiera de las ID DE SECUENCIA Nº: 16-24.

9. Un compuesto que inhibe la activación del complemento, que comprende un péptido que posee una secuencia:

Xaa1 – Cys – Val – Xaa2 – Gln – Asp – Xaa3 – Gly – Xaa4 – His – Arg – Cys – Xaa5 (ID DE SECUENCIA Nº: 26) ;

en la que:

Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ó un dipéptido Gly-Ile; Xaa2 es Trp ó un análogo de Trp, donde el análogo de Trp es un análogo que posee un sustituyente alcanoilo inferior en la posición 1 del triptófano y tiene un carácter hidrófobo incrementado en comparación con Trp, con la condición de que, si Xaa3 es Trp, Xaa2 sea el análogo de Trp; Xaa3 es Trp ó un análogo de Trp que es un triptófano halogenado, que es una modificación química de su anillo de indol que incrementa el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol; Xaa4 es His, Ala, Phe ó Trp; Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido Thr-Asn ó Thr-Ala, ó un tripéptido Thr-Ala-Asn, donde un – OH carboxi-terminal de cualquiera de entre L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly ó Asn es sustituido de forma opcional por –NH2; y

los dos residuos de Cys están unidos mediante un enlace disulfúrico.

10. El compuesto de la reivindicación 10, en el que el análogo de Trp de Xaa2 es 1-formiltriptófano y Xaa4 opcionalmente es Ala.

11. El compuesto de la reivindicación 10, que comprende la ID DE SECUENCIA Nº: 25.

12. El compuesto de las reivindicaciones 9, 10 ú 11, que además comprende un componente peptídico adicional que extiende la retención in vivo del compuesto; en el que opcionalmente el componente peptídico adicional es un péptido de unión a albúmina; opcionalmente comprendiendo la ID DE SECUENCIA Nº: 39

13. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un péptido producido mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el péptido.

14. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es producido al menos en 5 parte mediante síntesis peptídica.

15. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto está PEGilado; opcionalmente comprendiendo la ID DE SECUENCIA Nº: 36.

16. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que inhibe la activación del complemento con una actividad al menos 100 veces mayor que la de un péptido que comprende la ID DE SECUENCIA Nº: 1 bajo condiciones de ensayo equivalentes.

17. El compuesto de la reivindicación 1, que comprende la ID DE SECUENCIA Nº: 23. 15

18. El compuesto de la reivindicación 1, que comprende la ID DE SECUENCIA Nº: 24.

FIG. 8