AGENTE CELULAR ANTIANGIOGÉNICO PARA LA TERAPIA DEL CÁNCER.

Un método para preparar una composición de células inmunes para el tratamiento de cáncer vascularizado,

que comprende células inmunes que reconocen Hsp47 o un péptido con la secuencia AVLSAEQRL como una señal deno matar y de esta manera tienen la capacidad de dañar selectivamente la vasculatura tumoral y no la vasculaturanormal con

a. la etapa de expandir ex vivo la composición de células inmunes generada a partir de una muestra de célulashematopoyéticas en un sistema de cultivo cerrado que comprende IL2, OKT3 e interferón gamma;

b. la etapa de evaluar la selectividad de las células expandidas respecto a la actividad lítica frente a lavasculatura tumoral comparada con la actividad lítica frente a la vasculatura normal

c. la etapa de ajustar la selectividad de la composición

Campo de la Invención La invención se refiere a métodos para usar las células del sistema inmune en el tratamiento de enfermedad proliferativa celular y cáncer.

Antecedentes de la Invención La inmunidad celular transferida adoptivamente constituye un factor principal para controlar la recaída en algunos pacientes con cáncer que están sometidos a transplante de células hematopoyéticas alogénicas. Los beneficios mediados por la inmunidad del transplante de médula ósea (BMT) se describieron por primera vez como el efecto "injerto contra leucemia" (GvL) (Sullivan et al. (1989) Blood 73:1720; Weiden et al. (1979) N. Engl. J. Med. 300:1068) . Tanto las células asesinas naturales (NK) como subconjuntos de células T contribuyen a GvL (Antin (1993) Blood 82:2273; Hauch et al. (1990) Blood 75:2250) . La depleción de células T de la población de las células hematopoyéticas del donante resulta en unas proporciones de recaída incrementadas después de BMT (Martín et al. (1985) Blood 66:664) . La infusión de linfocitos del donante en pacientes que han recaído después de BMT alogénico resulta en un porcentaje significativo de pacientes que consiguen remisiones completas duraderas (Kolb et al. (1995) Blood 86:2041; Porter et al. (1994) N. Engl. J. Med. 330:100) .

Varias poblaciones distintas de células T y NK se han expandido ex vivo y se han utilizado como células efectoras para la terapia inmune adoptiva. Estas poblaciones incluyen células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) , linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y células asesinas inducidas por citoquinas (CIK) .

Las células LAK son productos de cultivo a corto plazo dependientes de interleuquina-2 (IL-2) obtenidas de células NK. Las células LAK reconocen un amplio espectro de dianas de células tumorales y células tumorales autólogas in vitro. Sin embargo, su eficacia in vivo está limitada por su limitado potencial proliferativo y el requerimiento de la coaplicación de IL-2 (Rosenberg et al. (1985) J. Exp. Med. 161:1169) . La administración sistémica de IL-2 está asociada con toxicidades considerables, incluyendo destrucción endotelial masiva (Siegel et al. (1991) J. Clin. Oncol. 9:694) . La terapia en pacientes con células LAK ha causado una morbilidad significativa debido al síndrome de hiperpermeabilidad vascular asociado con destrucción endotelial (VLS) (Kotasek et al. (1988) Cancer Res 48:5528) .

Los TIL tienen una mayor especificidad para antígenos tumorales que las células LAK. Sin embargo, los TIL deben aislarse de un espécimen quirúrgico del paciente y su generación tiende a ser engorrosa y rinde pocas células. Los antígenos tumorales específicos no están disponibles frecuentemente para asegurar una expansión suficiente in vitro de los TIL para tratamientos sucesivos o escaladas de dosis (Rosenberg et al. (1988) N. Engl. J. Med. 319:1676) .

Las células CIK se generan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por cultivo en presencia de IFN-y, OKT-3, e IL-2. Los cultivos de células CIK se expanden rápidamente en ausencia de células diana, lo que resulta en la expansión preferente de la población que de otra manera no sería habitual de células Ta/p CD3+CD16+CD56+. Las células CIK tienen una actividad GvL superior in vivo si se comparan con las células LAK y son capaces de purgar ratones SCID de la carga tumoral hematopoyética letal sin la necesidad de la administración sistémica de IL-2 (Lu et al. (1994) J. Immunol. 153:1687) .

Compendio de la Invención La invención presenta un método, usos y composiciones como se definen en las reivindicaciones dependientes.

Las células T anérgicas de varios linajes pueden estimularse, en determinadas condiciones, con citoquinas para activar los mecanismos de célula efectora que permiten a las células atacar selectivamente la vasculatura tumoral. Sin estar vinculado a ninguna teoría particular, parece que esta función de la célula efectora es una evolutivamente arcaica que no está limitada a las células T alfa/beta o células T gamma/delta. La función de célula efectora deseada está presente en al menos una subclase de células conocida como células CIK. Además, la función de célula efectora también puede estar presente en determinadas células que no expresan un receptor de células T. Por ejemplo, la función puede estar presente en una subclase de células NK.

Las células inmunes de la descripción se refieren colectivamente como células T antiangiogénicas expandidas ex vivo ("células EAT") . Las células inmunes de la descripción pueden obtenerse a partir de las células del paciente que se va a tratar u otro sujeto, así pueden ser alogénicas o autólogas, y se expanden ex vivo para generar células con las propiedades deseadas y en una cantidad suficiente.

Se cree que la selectividad de las células EAT está regulada, al menos en parte, por uno o más de Hsp47, Hsp16, Hsp27, Hsp32 y posiblemente otras proteínas de choque térmico tales como Hsp65, Hsp70, Hsp72, Hsp94, Hsp90, Hsp96 y Hsp mayores de 100kD y menores de 60kD. Hsp47 pertenece a una familia de moduladores inmunes reconocidos que incluye, pero no está limitada a, Hsp47, subtipos HLA-A y receptores de IL-12. Así, las células EAT pueden presentar (es decir, expresar) un receptor en la superficie celular que se une a Hsp47, una molécula HLA (p. ej., HLA-A o un subtipo de HLA-A) , receptor de IL-12 o una de las proteínas Hsp mencionadas anteriormente.

Las células EAT pueden aislarse de una población de células asesinas activadas por selección positiva de células que expresan receptores como se ha indicado anteriormente, o por selección negativa que destruye o desecha las células que no tienen dichos receptores o que muestran reactividad frente a la vasculatura normal. Por ejemplo, pueden utilizarse células endoteliales cultivadas in vitro que bien se han preincubado hasta la saturación funcional con un miembro funcional de la familia Hsp47 de moduladores inmunes o que se han transformado genéticamente para secretar Hsp47 o una proteína relacionada para seleccionar células EAT que tienen las propiedades deseables. El uso de un péptido que corresponde a homologías compartidas entre los miembros de la familia Hsp47 de moduladores inmunes puede sustituir la expresión o uso de polipéptidos parciales o de longitud completa de este modulador inmune. Las células inmunes que atacan a las células endoteliales en presencia de una cantidad funcionalmente suficiente de Hsp47 (es decir, una cantidad que inhibiría la muerte por una dosis celular equivalente de células CIK, p. ej., usando un ensayo descrito más adelante) se eliminan por selección negativa. La selección positiva puede realizarse después de tinción con Hsp47 o un sustituto funcional y separación posterior por FACS de las células teñidas positivamente, o por reconocimiento y selección usando Hsp47 o un sustituto funcional inmovilizado (es decir, en lechos magnéticos, una columna u otro soporte sólido) . Pueden usarse métodos similares para la selección negativa. En algunas circunstancias, no es necesaria la purificación de las células EAT de la población en la que se han generado.

A diferencia de determinadas células usadas para la inmunoterapia celular del cáncer, las células EAT no causan el síndrome de hiperpermeabilidad vascular (VLS) , un efecto secundario muy grave, habitualmente potencialmente mortal de la inmunoterapia celular. VLS surge a partir del daño causado a las células endoteliales en la vasculatura normal por determinadas células NK activadas o células T activadas y puede implicar la activación o interacción con otras células del sistema inmune. Debido a las graves consecuencias de VLS, la inmunoterapia celular se considera generalmente apropiada sólo para pacientes que padecen cáncer renal terminal o melanoma terminal. Por el contrario, debido a que el riesgo de VLS asociado con la administración de células EAT es mínimo, las células EAT pueden usarse para el tratamiento de cánceres vascularizados generalmente, incluyendo cánceres no malignos, estadios tempranos de un cáncer, cáncer de cualquier grado y estadio e incluso trastornos que no son potencialmente mortales que están asociados con una vascularización inapropiada (p. ej., endometriosis) .

Muchos tipos de células EAT atacan directamente las células tumorales además de atacar la vasculatura tumoral. Así, dichas células EAT pueden ser particularmente eficaces para el tratamiento del cáncer. Debido a que las células EAT atacan la vasculatura tumoral pueden ser terapéuticamente eficaces para el tratamiento de cáncer vascularizado... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una composición de células inmunes para el tratamiento de cáncer vascularizado, que comprende células inmunes que reconocen Hsp47 o un péptido con la secuencia AVLSAEQRL como una señal de no matar y de esta manera tienen la capacidad de dañar selectivamente la vasculatura tumoral y no la vasculatura normal con

a. la etapa de expandir ex vivo la composición de células inmunes generada a partir de una muestra de células hematopoyéticas en un sistema de cultivo cerrado que comprende IL2, OKT3 e interferón gamma;

b. la etapa de evaluar la selectividad de las células expandidas respecto a la actividad lítica frente a la vasculatura tumoral comparada con la actividad lítica frente a la vasculatura normal

c. la etapa de ajustar la selectividad de la composición.

2. Una composición de células inmunes para el tratamiento de cáncer vascularizado que comprende células CIK que reconocen Wsp47 o un péptido con la secuencia AVLSAEQRL como una señal de no matar y de esta manera tiene la capacidad de dañar selectivamente la vasculatura tumoral y no la vasculatura normal en la que la actividad lítica de la composición se ajusta de manera que al menos 50% de las células expandidas ex vivo matan selectivamente a las células endoteliales vasculares asociadas con el tumor comparado con las células endoteliales vasculares asociadas con los tejidos normales.

3. Una composición de células inmunes producida por el método de la reivindicación 2 en la que las células expandidas ex vivo comprenden células que expresan tanto CD3 como CD56.

4. Una composición de células inmunes producida por el método de la reivindicación 2 en la que las células expandidas ex vivo comprenden células que matan a las células tumorales.

5. Una composición de células inmunes producida por el método de la reivindicación 2 que comprende además un compuesto quimioterapéutico.

6. Una composición de células inmunes producida por el método de la reivindicación 2 que comprende además un agente que une las células expandidas ex vivo con un compuesto seleccionado.

7. La composición de células inmunes de la reivindicación 6 en la que el agente es un anticuerpo biespecífico.

8. La composición de células inmunes de la reivindicación 6 en la que el agente comprende al menos dos anticuerpos unidos covalentemente.

9. La composición de células inmunes de la reivindicación 6 en la que el agente comprende un anticuerpo que se une a las células expandidas ex vivo.

10. La composición de células inmunes de la reivindicación 9 en la que el compuesto seleccionado está unido covalentemente al anticuerpo.

11. La composición de células inmunes de la reivindicación 9 en la que el compuesto seleccionado está unido no covalentemente al anticuerpo.

12. La composición de células inmunes de la reivindicación 6 en la que el compuesto seleccionado se selecciona del grupo que consiste en una toxina, un anticuerpo, una molécula marcada de manera detectable, un inmunomodulador y un compuesto radiactivo.

13. Uso de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer que estimula la neoangiogénesis, en la que las células expandidas ex vivo son autólogas para el paciente.

14. El uso de la reivindicación 13 en el que el tumor es un tumor sólido.

15. El uso de la reivindicación 13 en el que las células ex vivo son capaces de replicarse en cultivo.

16. El uso de la reivindicación 13 en el que la composición se administra sin la coadministración de una citoquina.

17. El uso de la reivindicación 13 en el que la composición no se administra en los cinco días posteriores a la administración de una citoquina.

18. El uso de la reivindicación 13 en el que al menos 105 de las células expandidas ex vivo se administran en un día dado.

19. El uso de la reivindicación 13 en el que la composición se administra al menos dos veces en 7 días.

20. El uso de la reivindicación 13 en el que la composición se administra al menos dos veces en 30 días.

21. El uso de la reivindicación 13 en el que el paciente padece un cáncer seleccionado de un cáncer en estadio 1, cáncer en estadio 2, cáncer en estadio 3 o cáncer en estadio 4.

22. El uso de la reivindicación 13 en el que el paciente padece un cáncer seleccionado de un cáncer de grado bajo, cáncer de grado intermedio y cáncer de grado alto.

23. El método de la reivindicación 1 en el que las células se crecen en un contenedor de membrana.

24. El método de la reivindicación 1 para la expansión ex vivo de células inmunes con un receptor Hsp47 que comprende cultivar las células en un biorreactor con un sistema cerrado.

25. El uso de la reivindicación 13 en el que el tratamiento comprende tratamiento en consulta externa.

26. El uso de la reivindicación 13 en el que el paciente es un superviviente de cáncer.

27. El uso de la reivindicación 13 en el que el paciente está sano.

28. El uso de la reivindicación 13 en el que el paciente presenta un riesgo incrementado de padecer cáncer.

29. Un uso de una composición con una actividad lítica selectiva definida de cualquiera de las reivindicaciones

2-12 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un cáncer vascularizado en el que las células expandidas ex vivo son alogénicas para el paciente.

30. El uso de la reivindicación 29 en el que las células se han inmortalizado.

31. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2-12 en la que las células expandidas ex vivo contienen un transgén estable que comprende un gen suicida regulable.