Una preparación que comprende una glutenasa que puede atenuar la toxicidad del gluten para uso en un procedimiento de reducción de los síntomas de celiaquía y/o dermatitis herpetiforme en un sujeto mediante administración de dicha preparación a dicho sujeto,

en la que dicha glutenasa es una prolil-endopeptidasa (PEP)

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 1953 se reconoció por primera vez que la ingestión de gluten, una proteína alimentaria común presente en trigo, cebada y centeno, producía una enfermedad en individuos sensibles. El gluten es una mezcla compleja de glutenina rica en glutamina y prolina y moléculas de prolamina, que se cree que es responsable de la inducción de enfermedad. La ingestión de tales proteínas por individuos sensibles produce un aplanamiento del revestimiento epitelial similar a alfombra normalmente lujoso del intestino delgado que se sabe que es responsable de la eficaz y extensa digestión terminal de péptidos y otros nutrientes. Síntomas clínicos de la celiaquía incluyen fatiga, diarrea crónica, intolerancia de nutrientes, pérdida de peso, distensión abdominal, anemia, además de un riesgo sustancialmente posible del desarrollo de osteoporosis y tumores malignos intestinales (linfoma y carcinoma). La enfermedad tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 200 en poblaciones europeas.

Una enfermedad relacionada es la dermatitis herpetiforme, que es una erupción crónica caracterizada por grupos de vesículas intensamente pruríticas, pápulas y lesiones similares a urticaria. Los depósitos de IgA se producen en casi toda la piel de aspecto normal y perilesional. La enteropatía asintomática sensible al gluten se encuentra en el 75 al 90% de los pacientes y en algunos de sus parientes. La aparición es normalmente gradual. El picor y el escozor son intensos, y el rascarse frecuentemente oculta las lesiones primarias con eczematización de piel cercana, conduciendo a un diagnóstico erróneo de eczema. El estricto cumplimiento terapéutico de una dieta sin gluten durante periodos prolongados puede controlar la enfermedad en algunos pacientes, obviando o reduciendo el requisito de farmacoterapia. Algunas veces se recetan dapsona, sulfapiridina y colchicinas para aliviar el picor.

Generalmente se considera que la celiaquía es una enfermedad autoinmunitaria y los anticuerpos encontrados en el suero de los pacientes soportan una teoría de una naturaleza inmunológica de la enfermedad. Los anticuerpos para la transglutaminasa de tejido (tTG) y la gliadina aparecen en casi el 100% de los pacientes con celiaquía activa, y la presencia de tales anticuerpos, particularmente de la clase IgA, se ha usado en el diagnóstico de la enfermedad.

La gran mayoría de los pacientes expresa las moléculas HLA-DQ2 [DQ(a1*0501, b1*02)] y/o DQ8 [DQ(a1*0301, b1*0302)]. Se cree que la lesión intestinal se produce por interacciones entre oligopéptidos de gliadina específicos y el antígeno HLA-DQ2 o DQ8, que a su vez induce la proliferación de linfocitos T en las capas subepiteliales. Los linfocitos colaboradores T1 y las citocinas desempeñan aparentemente una función importante en un proceso inflamatorio local que conduce a atrofia vellositaria del intestino delgado.

Actualmente no hay una buena terapia para la enfermedad, excepto evitar completamente todos los alimentos que contengan gluten. Aunque la eliminación del gluten ha transformado el pronóstico para niños y lo ha mejorado sustancialmente para adultos, algunas personas todavía mueren de la enfermedad, principalmente adultos que tenían una enfermedad grave desde el principio. Una causa importante de muerte es la enfermedad linforreticular (especialmente linfoma intestinal). No se sabe si una dieta sin gluten disminuye este riesgo. La remisión clínica aparente está frecuentemente asociada a recaída histológica que sólo se detecta por biopsias de evaluación o por un aumento de los títulos de EMA.

El gluten se usan tan ampliamente, por ejemplo, en sopas comerciales, salsas, helados, perritos calientes y otros alimentos que los pacientes necesitan listas detalladas de productos alimenticios para evitarlos y consejo experto de un bromatólogo familiar con la enfermedad celíaca. La ingestión de incluso pequeñas cantidades de gluten puede evitar la remisión o inducir recaída. También pueden requerirse vitaminas complementarias, minerales y antianémicos, dependiendo de la deficiencia. Algunos pacientes responden mal o no responden a la eliminación del gluten, tanto debido a que el diagnóstico es incorrecto como debido a que la enfermedad es resistente al tratamiento. En el último caso, los corticosteroides orales (por ejemplo, prednisona 10 a 20 mg dos veces al día) pueden inducir respuesta.

En vista de la naturaleza grave y extendida de la celiaquía, se necesitan procedimientos mejorados para tratar o mejorar los efectos de la enfermedad. La presente invención trata tales necesidades.

Messer y col., Gut, agosto de 1964, vol 5; 295-303, se refiere a estudios del mecanismo de destrucción de la acción tóxica del gluten de trigo en enfermedad celíaca mediante papaína bruta.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para tratar los síntomas de la celiaquía y/o la dermatitis herpetiforme disminuyendo los niveles de oligopéptidos tóxicos del gluten en productos alimenticios, tanto antes de como después de la ingestión por un paciente. La presente invención se refiere al descubrimiento de que ciertos oligopéptidos del gluten son resistentes a la escisión por las enzimas gástricas y pancreáticas, de que la presencia de tales péptidos produce efectos tóxicos y de que el tratamiento enzimático puede eliminar tales péptidos y sus efectos tóxicos. Por digestión con glutenasas que son prolil-endopeptidasas, estos oligopéptidos tóxicos se escinden en fragmentos, previniéndose o aliviándose así sus efectos tóxicos en pacientes con celiaquía o dermatitis herpetiforme.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una preparación que comprende una glutenasa que puede atenuar la toxicidad del gluten para uso en un procedimiento de reducción de los síntomas de celiaquía y/o dermatitis herpetiforme en un sujeto mediante la administración de dicha preparación a dicho sujeto, en el que dicha glutenasa es una prolil-endopeptidasa (PEP).

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para hacer que un producto alimenticio que contiene gluten sea menos tóxico para un individuo que padece celiaquía, comprendiendo dicho procedimiento poner dicho producto alimenticio que contiene gluten en contacto con una prolil-endopeptidasa in vitro, escindiéndose los péptidos de gluten inmunogénicos en el producto alimenticio que contiene gluten en fragmentos no tóxicos.

Estas y otras realizaciones de la invención se explican en este documento más adelante y en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto de la presente divulgación, un producto alimenticio se trata con una glutenasa antes del consumo por el paciente. En otro aspecto de la presente divulgación, una glutenasa se administra a un paciente y actúa internamente para destruir los oligopéptidos tóxicos, en otro aspecto de la presente divulgación, un organismo recombinante que produce una glutenasa se administra a un paciente. En otro aspecto de la presente divulgación se usa terapia génica para proveer al paciente de un gen que expresa una glutenasa que destruye los oligopéptidos tóxicos.

En un aspecto, la presente divulgación describe procedimientos para la administración de formulaciones entéricas de una o más glutenasas, pudiendo estar cada una presente como un agente único o una combinación de agentes activos. En otro aspecto de la presente divulgación, formas estabilizadas de glutenasas se administran al paciente, formas estabilizadas que son resistentes a la digestión en el estómago, por ejemplo, a condiciones ácidas. Procedimientos alternativos de administración incluyen modificación genética de células del paciente, por ejemplo, enterocitos, para expresar aumentos de niveles de peptidasas que pueden escindir oligopéptidos inmunogénicos de gliadina; pretratamiento de alimentos con glutenasas; la introducción de microorganismos que expresan tales peptidasas de manera que colonicen transitoria o permanentemente el tracto intestinal del paciente intestinal; y similares.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que contienen una o más glutenasas que son prolil-endopeptidasas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales formulaciones incluyen formulaciones en las que la prolil-endopeptidasa está contenida dentro de un recubrimiento entérico que permite la administración del agente activo al intestino y formulaciones en las que los agentes activos están estabilizados para resistir la digestión... [Seguir leyendo]

1. Una preparación que comprende una glutenasa que puede atenuar la toxicidad del gluten para uso en un procedimiento de reducción de los síntomas de celiaquía y/o dermatitis herpetiforme en un sujeto mediante administración de dicha preparación a dicho sujeto, en la que dicha glutenasa es una prolil-endopeptidasa (PEP).

2. Una preparación de acuerdo con la reivindicación 1 para uso en un procedimiento de reducción de los síntomas de celiaquía.

3. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha preparación es para administración con una comida.

4. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha preparación es para administración mediante incorporación de dicha preparación en un producto alimentario.

5. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha PEP es un miembro de la superfamilia de las serina-proteasas y tiene una tríada catalítica conservada compuesta por los residuos Ser, His y Asp.

6. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha PEP tiene una kcat/Km de al menos 250 s-1M-1 bajo condiciones fisiológicas para escindir un péptido seleccionado del grupo que consiste en QLQPFPQPQLPY (SEQ ID NO: 1), PQPQLPYPQPQLPY (SEQ ID NO: 3), QPQQSFPQQQ (SEQ ID NO: 13), QLQPFPQPELPY (SEQ ID NO: 14), PQPELPYPQPELPY (SEQ ID NO: 15) y QPQQSFPEQQ (SEQ ID NO: 16) en fragmentos no tóxicos para un paciente con celiaquía.

7. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicha kcat/Km es al menos

25.000 s-1M-1.

8. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha PEP tiene una actividad específica de al menos 2,5 U/mg para la escisión de un péptido que comprende Z-Gly-Pro-pNA, en la Z es un grupo benciloxicarbonilo, pNA es para-nitroanilida y 1 U es la cantidad de enzima requerida para catalizar la reposición de 1 μmol de sustrato por minuto.

9. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha PEP es una forma purificada o recombinante de una prolil-endopeptidasa que se produce naturalmente.

10. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha PEP es de un organismo seleccionado del grupo Flavobacterium meningosepticum, Aeromonas hydrophila, Sphingomonas capsulata, Aeromonas punctata, Novosphingobium capsulatum y Pyrococcus furiosus.

11. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además una o varias glutenasas y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Una preparación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que es una forma estabilizada resistente a condiciones ácidas.

13. Una preparación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que dicha PEP está en el grupo de clasificación EC 3.4.21.26.

14. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 1, formulada con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica.

15. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica es adecuada para administración por vía oral.

16. Una preparación para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en la que dicha formulación farmacéutica está contenida en un recubrimiento entérico.

17. Un procedimiento in vitro para hacer que un producto alimenticio que contiene gluten sea menos

tóxico para un individuo que padece celiaquía, comprendiendo dicho procedimiento poner dicho producto alimenticio que contiene gluten en contacto con una prolil-endopeptidasa, en el que los péptidos del gluten inmunogénicos en el producto alimenticio que contiene gluten se escinden en fragmentos no tóxicos.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el producto alimenticio es harina de trigo que contiene gluten y la eficacia del procedimiento se prueba por la determinación de la escisión de péptidos de gliadina por EM-CL.

19. Un producto alimenticio preparado mediante el procedimiento de la reivindicación 17 ó 18, 10 comprendiendo dicho producto alimenticio oligopéptidos tóxicos del gluten escindidos en fragmentos no tóxicos.