TECNOLOGÍA DE LANTIONINA ORTOGONAL PROTEGIDA DE FORMA DIFERENCIAL.

Tecnología de lantionina ortogonal protegida de forma diferencial Antecedentes ES 2 367 843 T3 El desarrollo de antibióticos revolucionó la práctica de la medicina en la segunda mitad del siglo XX. La mortalidad debida a enfermedades infecciosas disminuyó notablemente durante este periodo. Armstrong y col., (1999) PAMA. 281, 61-66. Desde 1982, sin embargo, las muertes como resultado de enfermedades infecciosas han ascendido de forma constante en paralelo con el aumento de patógenos resistentes a antibióticos. Una amplia diversidad de bacterias médicamente importantes se están volviendo cada vez más resistentes a los antibióticos usados comúnmente en el tratamiento de infecciones clínicas. Han aparecido miles de informes y libros en la bibliografía durante los últimos 20 años que documentan este fenómeno. Armstrong y col., (1999) PAMA. 281, 61-66; Dessen y col., (2001) Curr. Drug Targets Infect. Disord. 1, 11-16; Rapp (2000) Surg Infect (Larchmt). 1, 39-47; Benin y Dowell (2001) Antibiotic resistance and implications for the appropriate use of antimicrobial agents, Humana Press, Totowa, NJ. Aunque existe la necesidad de enseñar un uso más apropiado de los antibióticos, de forma más importante existe la necesidad de nuevos antibióticos. Se considera que la vancomicina es la última línea de defensa contra muchas infecciones bacterianas graves. El descubrimiento de cepas de bacterias patógenas con resistencia a la vancomicina es alarmante; presagia el aumento de patógenos multirresistentes a fármacos que serían intratables con los fármacos disponibles actualmente. El temor es que volveremos, de hecho, a la era anterior a los antibióticos a menos que se desarrollen pronto nuevos antibióticos. Existe una pequeña clase de antibióticos estructuralmente novedosos denominados lantibióticos (bacteriocinas de Clase I) que pueden dividirse en 5 subclases basándose en diferencias en su química y en su biosíntesis: Tipo A(I), Tipo A(II), Tipo B, de Dos Componentes y aquellos de estructuras desconocidas. Esta clase de antibióticos se ha conocido durante décadas pero no se ha ensayado exhaustivamente para determinar su utilidad potencial en el tratamiento de enfermedades infecciosas, aunque se sabe que muchos lantibióticos tanto son potentes como tienen un amplio espectro de actividad, particularmente contra especies gram positivas. La principal razón para esto es la dificultad general de obtener estas moléculas en cantidades rentables suficientes para permitir su ensayo y comercialización. La Nisina A (Figura 1) proporciona un buen ejemplo de un lantibiótico, y del número y tipos de complejidades químicas asociadas con lantibióticos. Los lantibióticos son ricos en los aminoácidos que contienen azufre, lantionina (Lan, ala-S-ala) y, frecuentemente, 3-metil lantionina (MeLan, abu-S-ala). La Lan consiste en restos de alanina que están conectados mediante puentes tioéter para crear estructuras de anillo que son críticas para la bioactividad. Típicamente hay 3-5 anillos de este tipo en un lantibiótico, y con frecuencia muchos de los anillos están superpuestos entre sí. Se cree que Lan y MeLan siempre tienen la estereoquímica meso. Además de los restos Lan y MeLan, pueden encontrarse en los lantibióticos otros aminoácidos modificados post-traduccionalmente (Figura 2), tales como 2,3-dideshidroalanina (Dha), 2,3 dideshidrobutirina (Dhb), derivados de lantionina insaturados, tales como S-amino vinil-D-cisteína (AviCys) y S-amino-D-metilcisteína, así como restos de D-alanina, 2-oxopropionilo, 2oxobutirilo e hidroxipropionilo. Como en el caso de la Nisina A, las estructuras de anillo generadas por Lan y MeLan pueden estar superpuestas (por ejemplo, anillos D y E), añadiendo más a la complejidad de la molécula. Las bacterias Gram positivas son responsables de la biosíntesis de los lantibióticos conocidos. Generan la molécula madura usando una serie de etapas enzimáticas secuenciales que actúan sobre un prepropéptido sintetizado ribosómicamente. Los genes responsables de codificar las enzimas modificadoras se agrupan típicamente en un fragmento de ADN de 8-10 Kb que puede residir en el cromosoma, un plásmido o como parte de un transposón. En los lantibióticos de Tipo A(I) todos los restos de serina y treonina en el prepéptido sintetizado ribosómicamente codificado por el gen lanA se deshidratan por una enzima codificada por el gen lanB, y estos aminoácidos deshidratados están implicados en la formación de enlaces tioéter con un resto de cisteína cercano que esté situado más hacia el extremo carboxilo de la molécula. Esta reacción está catalizada por la proteína expresada por el gen lanC. En el caso de ciertos lantibióticos, tales como epidermina y mutacina 1140, la cisteína C-terminal se descarboxila por la enzima expresada por el gen lanD y se convierte en una S-amino vinil-D-cisteína. Después del transporte fuera de la célula por el producto del gen lanT, la secuencia líder del prepropéptido modificado se escinde después por una proteasa extracelular codificada por lanP para producir un antibiótico maduro. Ra y col., (1996) Microbiology-Uk. 142, 1281-1288; Kupke y Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 139-150; Kuipers y col., (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 69, 161-169. Los intentos de estudiar los lantibióticos para determinar su utilidad potencial en aplicaciones terapéuticas se han visto obstaculizados por la dificultad de obtenerlos en cantidades suficientes o con una pureza suficiente. De los 40 lantibióticos más o menos caracterizados hasta la fecha (Chatterjee y col., (2005) Chemical Reviews. 105, 633 683), 2 ES 2 367 843 T3 sólo el lantibiótico de Tipo A(I), Nisina A, producido por Streptococcus lactis, se ha generado en cantidades comerciales y ha encontrado una amplia aplicación como conservante alimentario durante los últimos 50 años. El uso generalizado a largo plazo de Nisina A sin el desarrollo de una resistencia significativa (DelvesBroughton y col., (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 193-202) ha proporcionado un fuerte ímpetu al desarrollo de lantibióticos adicionales para diversas aplicaciones. La producción a gran escala de Nisina A se realiza usando un procedimiento de fermentación que se ha refinado con los años. Recientemente se ha presentado un protocolo de purificación para Nisina A como patente de Estados Unidos (USPA 2004/0072333). El protocolo usaba un cóctel de proteasas costosas seguido de cromatografía en columna. Sin embargo, no existe ningún procedimiento comercialmente viable publicado para la purificación de Nisina A. Esto demuestra el actual interés en encontrar un procedimiento adecuado de producción de Nisina A pura y otros lantibióticos para aplicaciones terapéuticas. Se presentan de por sí diversas opciones potenciales para la producción de lantibióticos a gran escala. Desde el punto de vista del coste de los materiales, los procedimientos de fermentación serían indiscutiblemente el mejor procedimiento. Los procedimientos de fermentación actuales para muchos lantibióticos producen cantidades de microgramos por litro, lo cual no es suficiente para el desarrollo de fármacos. Como alternativa, se ha explorado la producción in vitro usando la maquinaria de modificación de lantibióticos en los lantibióticos de Tipo A(l). Kupke y Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69 , 39-150; Kuipers y col., (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 161-169. Las enzimas responsables de la modificación post-traduccional del prepropéptido de lantibiótico no son activas en lisados sin células o como entidades purificadas, con la excepción de LandD. Kupke y Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 69, 139-150; 10; Kupke y Gotz (1997) Journal of Biological Chemistry. 272, 4759-4762; Kupke y col., (1992) Journal of Bacteriology. 174, 5354-5361; Kupke y col., Fems Microbiology Letters. 112, 43-48 ; Kupke y col., (1995) Journal of Biological Chemistry. 270, 11282-11289; Kupke y col., (1994) Journal of Biological Chemistry. 269, 5653-5659. En el caso de los lantibióticos de Tipo A(II) se ha descrito recientemente en Science que es posible la síntesis in vitro de lacticina 481. Las moléculas que pertenecen a este grupo y los lantibióticos de Tipo B usan sólo una única enzima multicabeza, LanM, para lograr la formación de los restos de Dha, Dhb, Lan y MeLan. Xie y col. (2004) Science, 303, 679-681. El informe de biosíntesis de lacticina 481 no proporcionó ninguna información detallada respecto al rendimiento o la pureza, pero su trabajo se realizó en la... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de síntesis de un polipéptido con puentes intramoleculares que comprende dos puentes intramoleculares superpuestos, que comprende: a) unir covalentemente el extremo carboxi-terminal libre de un primer puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial de fórmula con un soporte sólido o con el extremo amino-terminal libre de un aminoácido o polipéptido opcionalmente unido a un soporte sólido, y en el que L n representa cadenas laterales de aminoácidos unidas covalentemente, en el que D, E y G son grupos protectores, cada uno de los cuales se elimina selectivamente en condiciones de reacción diferentes, y en el que las condiciones de reacción para la eliminación del grupo protector D son diferentes de las de la eliminación del grupo protector de amino de los aminoácidos del resto de la cadena polipeptídica; b) eliminar el grupo protector E para formar un extremo amino-terminal libre; c) añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; d) opcionalmente repetir c) una o más veces; e) unir covalentemente el extremo carboxi-terminal libre de un segundo puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial de fórmula con el extremo amino-terminal libre, en el que L n es como se ha definido anteriormente, en el que M, Q y T son grupos protectores, cada uno de los cuales se elimina selectivamente en condiciones de reacción diferentes, en el que D y M se eliminan solamente en condiciones diferentes, en el que G y T se eliminan solamente en condiciones diferentes, en el que las condiciones de reacción para la eliminación del grupo protector M son diferentes de las de la eliminación del grupo protector de amino de los aminoácidos del resto de la cadena polipeptídica, y en el que E y Q se eliminan en condiciones diferentes de las que eliminarán D y de las que eliminarán M; f) eliminar el grupo protector Q para formar un extremo amino-terminal libre; g) opcionalmente añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; h) opcionalmente repetir g) una o más veces; i) eliminar el grupo protector G del primer puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial para formar un extremo carboxi-terminal libre; j) acoplar el extremo carboxi-terminal libre al extremo amino-terminal libre; k) eliminar el grupo protector D del primer puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial para formar un extremo amino-terminal libre; l) opcionalmente, añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; m) opcionalmente repetir l) una o más veces; n) eliminar el grupo protector T del segundo puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial formando un extremo carboxi-terminal libre; o) acoplar el extremo carboxi-terminal libre al extremo amino-terminal libre; p) eliminar el grupo protector M del segundo puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial para formar un extremo amino-terminal libre; y q) opcionalmente añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger 22 ES 2 367 843 T3 el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; y r) opcionalmente repetir q) una o más veces. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además: a) eliminar al grupo protector amino-terminal del polipéptido unido al soporte sólido para formar un extremo amino-terminal libre; b) acoplar un puente intramolecular ortogonal protegido de forma diferencial de fórmula con el extremo amino-terminal libre, en el que L n representa cadenas laterales de aminoácidos unidas covalentemente, en el que D, E y G son grupos protectores, cada uno de los cuales se elimina selectivamente en condiciones de reacción diferentes, y en el que las condiciones de reacción para la eliminación del grupo protector D son diferentes de las de la eliminación del grupo protector de amino de los aminoácidos del resto de la cadena polipeptídica; c) eliminar el grupo protector E para formar un extremo amino-terminal libre; d) añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; e) opcionalmente repetir d) una o más veces; f) eliminar el grupo protector G para formar un extremo carboxilo-terminal libre; g) acoplar el extremo carboxilo-terminal libre de f) al extremo amino-terminal libre; h) eliminar el grupo protector D para formar un extremo amino-terminal libre; i) opcionalmente, añadir un aminoácido amino-protegido al extremo amino-terminal libre y después desproteger el aminoácido para dar un nuevo extremo amino-terminal libre; j) opcionalmente repetir i) una o más veces; y k) opcionalmente repetir las etapas b)-j). 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los puentes intramoleculares ortogonales protegidos de forma diferencial son lantioninas. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido con puentes intramoleculares es un lantibiótico. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que D, E, M y Q se seleccionan de Fmoc, Alloc e IvDde. 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que G y T se seleccionan del grupo que consiste en éster propargílico y éster bencílico. 7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los puentes intramoleculares se seleccionan del grupo que consiste en ß-metil lantionina (MeLan), S-[(Z)-2-aminovinil]-D-cisteína (AviCys) y S-[(Z)-2-Aminovinil]-2-metil-Dcisteína. 8. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el lantibiótico se selecciona del grupo que consiste en Nisina A, Nisina Z, Subtilina, Ericina S, Ericina A, Estreptina, Epidermina, [Val1-Leu6]-epidermina, Galidermina, Mutacina 1140, Mutacina B-Ny266, Mutacina III, Mutacina I, Pep5, Epilancina K7, Epicidina 280, Lacticina 481, Variacina, Mutacina II, Estreptococina A-FF22, Salivaricina A, [Lys2-Phe7]-salivaricina A, Plantaricina C, Sublancina 168, Butirivibriocina OR79A; Cinamicina, Duramicina, Duramicina B, Duramicina C, Curamicina C, Ancovenina, Mersacidina, Actagardina, Ala(0)-actagardina, Subtilocina A, Lacticina 3147A1, Lacticina 3147A2, Estafilococina C55, Estafilococina C55ß, Plantaricina W, Plantaricina Wß, Citolisina LL y Citolisina LS. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el lantibiótico es Nisina A o un análogo de la misma. 23 ES 2 367 843 T3 24 ES 2 367 843 T3 ES 2 367 843 T3 26 ES 2 367 843 T3 27 Alquilación PTC