Muteína de IL-15 caracterizada porque tiene una secuencia que se puede obtener de la IL-15 natural madura humana por al menos una sustitución,

eliminación o adición en la región que se extiende del resto 44 al resto 52, correspondiendo esta numeración de restos a la IL-15 natural madura humana, con la condición de que la muteína de IL-15 resultante de eso tenga una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no sea significativamente diferente o sea mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, y caracterizada porque es un agonista de la IL-15, en la que dicha al menos una sustitución, eliminación o adición comprende la sustitución de al menos uno de los restos 45, 51, 52 por un aminoácido seleccionado de D, E, K, R.

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

La presente memoria descriptiva describe la identificación de un sitio de unión de la IL-15 humana para el IL-15Ralfa. También se proporcionan agonistas y antagonistas de la IL-15 que se dirigen a la cadena IL15Ralfa, es decir, la cadena que confiere al complejo receptor IL-15R su especificidad por la IL-15.

En la presente solicitud, se hace referencia a diferentes publicaciones científicas. Estas publicaciones están listadas al final de la parte de ejemplos, antes de las reivindicaciones. En el texto de la solicitud se hace referencia a las mismas mediante un número entre paréntesis; este número corresponde al número en la lista de publicaciones.

ANTECEDENTES TÉCNICOS:

La interleuquina-15 (IL-15) se identificó como una nueva citoquina que podía sustituir la IL-2 en el mantenimiento de la proliferación de una línea de linfocitos T murina (1, 2). Ambas citoquinas pertenecen a la familia de haces de 4 hélices alfa (3). Inicialmente se encontró que la IL-15 imitaba la mayoría de las actividades in vitro producidas por la IL-2 in vitro, incluyendo la inducción de proliferación y citotoxicidad por linfocitos T activados (1) y linfocitos citolíticos naturales (2, 4), la coestimulación de la proliferación de linfocitos B y síntesis de inmunoglobulinas (5) y quimioatracción de linfocitos T (6). Esta redundancia se explica por el uso común dentro de sus receptores funcionales del complejo de señalización IL-2Rβ/γ.

Este complejo IL-2Rβ/γ es un receptor de afinidad intermedia común para la IL-2 y la IL-15 (Kd = 1 nM), y ambas citoquinas compiten por la unión a este receptor (7). La especificidad de la citoquina la confieren las cadenas privadas adicionales, IL-2Rα e IL-15Rα que están estructuralmente relacionadas (8). Estas dos cadenas contienen dominios estructurales (llamados dominios sushi) encontrados previamente en algún complemento y moléculas de adhesión (9). El IL-2Rα contiene dos de dichos dominios, mientras que IL-15Rα contiene solo uno. Una diferencia destacable es que la IL-2 se une a su IL-2Rα específico con una afinidad (Kd = 10 mM) mucho menor que la IL-15 al IL-15Rα (Kd = 0,05 nM). Cada cadena específica se puede asociar con el complejo IL-2Rβ/γ para formar un receptor de alta afinidad funcional (αβγ), específico de citoquina (10-12).

Debido a que comparten este complejo IL-2Rβ/γ, ambas citoquinas desencadenan rutas de señalización corriente abajo similares, que incluyen la activación de las tirosina quinasas Jak-1/Jak-3 y posterior translocación nuclear de Stat-3 y Stat-5 fosforilados, activación de tirosina quinasas Lck y Syk, activación de la ruta de MAP quinasa, e inducción de Bcl-2 (13, 14). A diferencia de EL-2Rβ e IL-2Rγ que son necesarios para la transducción de señales, los receptores específicos IL-2Rα e IL-15Rα tienen colas intracelulares cortas (13 y 41 aminoácidos respectivamente) y se considera que el IL-2Rα tiene una función en la transducción de señales. Aunque los estudios iniciales han señalado la función prescindible de la cola intracelular de IL-15Rα en la señalización (8), datos más recientes sugieren que el IL-15Rα puede mediar algunas funciones intracelulares (15-17).

En contraste con la redundancia de la función general observada in vitro, algunos hallazgos señalan a acciones complementarias e incluso opuestas de la IL-2 e IL-15 in vivo. Realmente, mientras que la expresión del gen de IL-2 y de IL-2Rα está restringida principalmente al compartimento de linfocitos T activados, los transcritos de IL-15 y de IL-15Rα son expresados por diferentes tipos de células y tejidos (monocitos, células dendríticas y del estroma, queratinocitos, placenta, músculo esquelético, corazón), sugiriendo funciones adicionales para el sistema de la IL-15 además del sistema inmunitario (7, 8). Se han descrito células que expresan el IL-15Rα en ausencia de IL-2Rβ y/o IL-2Rγ y algunas de ellas responden a la IL-15 (17, 18), sugiriendo la existencia de nuevos complejos receptores funcionales de IL-15 no implicados en IL-2Rβ y/o IL-2Rγ.

También se han sugerido distintas funciones para la IL-2 e IL-15 a partir de experimentos en ratones con genes inactivados. Mientras que los ratones IL-2-/-e IL-2Rα-/-desarrollan expansión de linfocitos T y B exacerbada, asociada con manifestaciones autoinmunitarias, los ratones EL-15-/-y IL-15Rα-/-por el contrario tienen poblaciones de linfocitos T y B normales y presentan una deficiencia grande de linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T citolíticos naturales, linfocitos intraepiteliales y linfocitos T de memoria CD8+ (19, 20). Un estudio reciente sugiere que, al contrario de los resultados obtenidos in vitro, la función principal de la IL-2 in vivo es limitar la expansión continua de los linfocitos T activados, mientras que la IL-15 es crítica para iniciar la división de linfocitos T (21).

Una serie de estudios han contribuido a la identificación de trastornos humanos en los que tiene una relevancia clínica y un potencial beneficio el dirigirse al sistema de IL-15. Entre ellos, hay enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, enfermedades infecciosas, rechazo de trasplantes, cáncer e inmunodeficiencias (22, 23). En este contexto, el diseño racional de agonistas y antagonistas del sistema de IL-15/receptor es un problema importante y requiere un conocimiento preciso de la estructura del complejo del receptor de IL-15 de alta afinidad.

Una serie de estudios de mutagénesis de IL-2 humana y murina han conducido a la identificación de varios restos implicados en la unión a las cadenas IL-2Rα, β y γ. A partir de estos estudios, los restos K35, R38, F42 y K43, todos situados en el bucle A-B de la IL-2 humana, están implicados en su unión a la cadena IL-2Rα, mientras que los restos D20 en la hélice A y N88 en la hélice C están implicados en la unión a la cadena IL-2Rβ, y Q126 en la hélice D es crucial para la unión a la cadena IL-2Rγ (24-26). Se identificaron regiones similares en la IL-2 de ratón (27).

Por el contrario, hay muy pocos datos disponibles en relación con los restos en la IL-15 implicados en la unión a los diferentes receptores de la IL-15.

Algunas mutaciones en la IL-15 humana (D8 y Q108) que son análogas a las descritas para la IL-2 humana, sugieren que las correspondientes regiones en la IL-15 están implicadas en la unión a las subunidades IL2Rβ y γ, respectivamente (28).

La presente invención sigue diferentes procedimientos complementarios, incluyendo el análisis de interacción de ligando y receptor, la inducción de la actividad biológica, barrido de péptidos, y mutagénesis dirigida, para definir el epítopo de la IL-15 responsable de la unión de alta afinidad a la cadena IL-15Rα.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN:

La presente invención describe un epítopo de la IL-15 humana responsable de la unión de alta afinidad a la cadena IL-15Rα. Este epítopo de IL-15/IL-15Ralfa consiste esencialmente en dos péptidos: el péptido 1 (44LLELQVISL52; SEQ ID NO: 4 en la Figura 1B) que está situado en la hélice B de la IL-15, y el péptido 2 (64ENLII68; SEQ ID NO: 6 en la Figura 1B) o el péptido 2a (64ENLIII69; SEQ ID NO: 67 en la Figura 1B) que están situados en la hélice C.

En la presente solicitud, todos los números de restos se cuentan con referencia a la secuencia entera de la proteína de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 2 mostrada en la Figura 1A). El péptido 1 y el péptido 2 o 2a juntos configuran una superficie epitópica que es responsable de la unión de alta afinidad de la IL-15 al IL-15Rα. Los péptidos 2 y 2a también están implicados en el reclutamiento de la subunidad de transducción IL-2Rβ

La presente invención también describe agonistas y antagonistas de la IL-15, y más en particular agonistas y antagonistas de la IL-15 que derivan de dichos péptidos epitópicos por mutación (véase las Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 9, 10).

La invención se define por las reivindicaciones.

Los agonistas descritos en el presente documento incluyen aquellas muteínas de la IL-15 en las que al menos uno de L45, S51 y L52 se ha sustituido por un grupo cargado (D, E, R o K); véase las figuras 2A y 2C. Un agonista particularmente preferido comprende L45 sustituido por D o E y/o S51 sustituido por D, y/o L52 sustituido por D: estas muteínas de IL-15 presentan propiedades de unión... [Seguir leyendo]

1. Muteína de IL-15 caracterizada porque tiene una secuencia que se puede obtener de la IL-15 natural madura humana por al menos una sustitución, eliminación o adición en la región que se extiende del resto 44 al resto 52, correspondiendo esta numeración de restos a la IL-15 natural madura humana, con la condición de que la muteína de IL-15 resultante de eso tenga una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no sea significativamente diferente o sea mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, y caracterizada porque es un agonista de la IL-15, en la que dicha al menos una sustitución, eliminación o adición comprende la sustitución de al menos uno de los restos 45, 51, 52 por un aminoácido seleccionado de D, E, K, R.

2. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 45 por D, E, K o R.

3. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32.

4. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 51 por D, E, K o R.

5. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36.

6. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 52 por D, E, K o R.

7. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 1 ó 6, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40.

8. Muteína de IL-15 caracterizada porque tiene una secuencia que se puede obtener de la IL-15 natural madura humana por al menos una sustitución, eliminación o adición en la región que se extiende del resto 64 al resto 69, correspondiendo esta numeración de restos a la IL-15 natural madura humana, con la condición de que la muteína de IL-15 resultante de eso tenga una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no sea significativamente diferente o sea mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, y caracterizada porque es un antagonista de la IL-15, en la que dicha al menos una sustitución, eliminación o adición comprende la sustitución de al menos uno de los restos 64, 65, 68, 69 por un aminoácido que se selecciona:

- de K, R para el resto 64,

- de D, E, K, R para los restos 65, 68, 69.

9. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 64 por K o R.

10. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

11. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 64 por K, D, E o R.

12. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8 u 11, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46.

13. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicha al menos una sustitución es una sustitución del resto 68 por K, D, E o R.

14. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 50.

15. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicha al menos una

sustitución es una sustitución del resto 69 por R, D, E o K.

16. Muteína de IL-15 de acuerdo con la reivindicación 8 ó 15, caracterizada porque tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 85 o SEQ ID NO: 82 o SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84.

17. Fragmento del agonista de la IL-15 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que todavía comprende la región 44-52 mutada, y que todavía tiene una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no es significativamente diferente o es mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, que todavía es un agonista de la IL-15.

18. Fragmento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-18.

19. Fragmento del antagonista de la IL-15 de una cualquiera de las reivindicaciones 8-16, que todavía comprende la región 64-69 mutada, y que todavía tiene una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no es significativamente diferente o es mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, y que todavía es un antagonista de la IL-15.

20. Fragmento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 19-28.

21. Fragmento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 77-80.

22. Ácido nucleico que codifica una muteína de IL-15 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, o un fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-21.

23. Vector que contiene al menos un ácido nucleico de la reivindicación 22.

24. Célula transfectada o transformada por un vector de acuerdo con la reivindicación 23.

25. Fármaco que comprende una muteína de IL-15 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y/o un fragmento de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, y que comprende opcionalmente un vehículo y/o excipiente y/o diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

26. Uso de una muteína de IL-15 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o de un fragmento de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, para fabricar un fármaco anticancerígeno o antiinmunodeficiencia.

27. Fármaco que comprende una muteína de IL-15 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-16, y/o un fragmento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 19-21, y que comprende opcionalmente un vehículo y/o excipiente y/o diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

28. Uso de una muteína de IL-15 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-16, o un fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, para fabricar un fármaco antiinflamatorio.

29. Procedimiento para cribar un agonista o antagonista de la IL-15, caracterizado porque comprende:

i. proporcionar una pluralidad de:

- muteínas de IL-15, que tienen una secuencia que se puede obtener de la IL-15 natural madura humana por al menos una sustitución, eliminación o adición en la región que se extiende del resto 44 al resto 52, y/o del resto 64 al resto 68, y/o del resto 64 al resto 69, correspondiendo esta numeración de restos a la IL-15 natural madura humana, con la condición de que la muteína de IL-15 resultante de eso tenga una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no sea significativamente diferente o sea mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa, y/o de

- fragmentos de dichas muteínas de IL-15, que todavía comprenden la región 44-52 mutada, y/o la región 64-68 mutada, y/o la región 64-69 mutada, y que todavía tienen una afinidad por la unión al IL-15Ralfa que no es significativamente diferente o es mayor que la afinidad de la IL-15 natural madura humana por la unión al IL-15Ralfa,

ii. comparar sus afinidades de unión respectivas por el IL-15Ralfa con la afinidad de unión de la IL-15 natural madura,

iii. seleccionar aquellas muteínas o fragmentos de muteínas que tienen una afinidad de unión que no es significativamente diferente o que es mayor que la de la IL-15 natural madura.

30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, que es para cribar un agonista de la IL-15, caracterizado porque comprende además:

iv. seleccionar al menos una actividad detectable inducible por la IL-15,

v. comparar el nivel de dicha actividad que es inducida en respuesta a las muteínas o fragmentos seleccionados en la etapa iii., con el inducido por la IL-15 natural madura,

vi. seleccionar aquellas muteínas o fragmentos que inducen un nivel de actividad que no es significativamente diferente o que es mayor que el de la IL-15 natural madura.

31. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, que es para cribar un antagonista de la IL-15, caracterizado porque comprende además:

iv. seleccionar al menos una actividad detectable inducible por la IL-15,

v. comparar el nivel de dicha actividad que es inducida en respuesta a las muteínas o fragmentos seleccionados en la etapa iii., con el inducido por la IL-15 natural madura,

vi. seleccionar aquellas muteínas o fragmentos que inducen un nivel de actividad que es menor que el de la IL-15 natural madura o que no inducen un nivel de actividad detectable.