SITIO DE UNIÓN DE ALTA AFINIDAD HGFR Y PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ANTAGONISTAS DEL MISMO.

Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer

Sitio de unión de alta afinidad de HGFR y procedimientos para la identificación de antagonistas del mismo Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al área de la proteína del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGFR). Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación del sitio de unión de alta afinidad del HGFR por su ligando, el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), y procedimientos para la identificación de antagonistas de HGFR que se dirigen al sitio de unión de alta afinidad de HGFR. Antecedentes de la invención El receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (también conocido como Met) es una tirosina quinasa y es el producto del oncogen c-met proto. Está constituido por una subunidad de 50 kDa y una subunidad ß de 145 kDa, que están unidos mediante enlace disulfuro, siendo la subunidad completamente extracelular, mientras que la subunidad ß incluye (desde el extremo N al C) una región extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa citoplásmico. El receptor dimérico /ß hetero maduro se genera mediante procesamiento proteolítico y glicosilación terminal de un precursor de una sola cadena de 170 kDa. El HGF, también conocido como Factor Scatter, es una glicoproteína de unión a heparina con un amplio espectro de actividades biológicas que incluyen proliferación celular, motilidad, supervivencia y morfogénesis. Se sintetiza y secreta como un precursor de una sola cadena inactivo, (pro-HGF) que se almacena en la matriz extracelular debido a su alta afinidad por los proteoglicanos. Pro-HGF experimentan escisión proteolítica en los restos R494- V495 para dar lugar a la forma activa de, un dímero /ß hetero ligado a disulfuro, donde la cadena está constituido por un dominio N-terminal seguido de cuatro dominios kringle y la cadena ß comparte homología estructural con la familia quimotripsina de las serina proteasas. Sin embargo, la cadena ß, carece de actividad proteolítica ya que dos de los tres restos críticos que forman la triada catalítica típica de las serina proteasas no se conservan en HGF. A pesar de su incapacidad para la señal, pro-HGF se une a Met con alta afinidad alta afinidad y desplaza el HGF activo. Recientemente, una serie de estudios de estructura - función han vertido alguna luz en las interacciones entre la parte extracelular de Met y HGF. La región extracelular Met tiene una estructura modular que abarca tres regiones funcionales: el dominio Sema (presente también en Semaforinas y Plexinas) que se extiende sobre los primeros 500 restos del extremo N de la proteína y tiene una estructura de hélice ß de siete hojas propulsor, el dominio PSI (también encontrado en Plexinas, Semaforinas e Integrinas) que cubre aproximadamente 50 restos y contiene cuatro enlaces disulfuro conservados, y 400 restos adicionales que unen el dominio PSI a la hélice transmembrana y están ocupados por cuatro dominios IPT (dominios relacionados con Inmunoglobulina presentes en Plexinas y factores de Transcripción). El HGF es un ligando bivalente que contiene un sitio de unión de alta afinidad para Met en las cadenas y un sitio de unión de baja afinidad en la cadena ß. La cooperación entre la cadena - y ß se requiere para la actividad biológica de HGF; mientras la cadena , y más precisamente el dominio N y el primer kringle, es suficiente para la unión de Met, la cadena ß es necesaria para la activación de Met. La resolución de la estructura cristalina de los dominios SEMA y PSI de Met en complejo con la cadena ß de HGF (véase i.a. WO-A-2005/108424) reveló que el sitio de unión de baja afinidad para HGF se encuentra en las hojas 2 - 3 de la hélice ß, y que la parte de HGF-ß que se une a Met es la misma región que las serina proteasas usan para unirse a sus sustratos o inhibidores. De manera importante, la determinación de la estructura cristalina de la cadena ß de HGF a resolución de 2,53 Å y análisis de mutagénesis específica desvelaban que los restos implicados en la unión de Met en el bolsillo de activación de la cadena ß de HGF se exponen a solamente después de la conversión proteolítica de pro-HGF, explicando de esta manera porque pro-HGF se une a Met con alta afinidad sin activarlo. Mientras que la interacción de baja afinidad entre la cadena ß de HGF y el dominio Sema de Met está bien caracterizado estructuralmente y funcionalmente, por el momento no está claro qué región de Met se une a las cadenas de HGF con alta afinidad. De este modo, el principal mecanismo por el que HGF activa Met todavía permanece escasamente entendido. Esto es algo sorprendente cuando se considera la gran importancia biológica y terapéutica de esta ruta. La señalización de HGF-Met es esencial durante la embriogénesis y en la regeneración de tejidos en la vida del adulto. De manera importante, la señalización dis regulada de HGF-Met juega un papel clave en la tumorigénesis y metástasis. La activación inapropiada de Met por diferentes mecanismos incluyendo estimulación autocrina de HGF, sobreexpresión del receptor, amplificación génica y mutación puntual se describe en una amplia diversidad de neoplasias humanas y se correlaciona con escasa prognosis. Estos hallazgos dieron como resultado un interés 2   creciente en la ruta HGF-Met como una diana para terapia de cáncer como se describe i.a. en Michieli et al., Cancer Cell 2004, 6 (1), 61 - 73; Xueyan et al., Molecular Cancer Therapeutics 2003, 2 (11), 1085 - 92; documento EP-A-0 520 158; Kaji et al., Cancer Gene Therapy 1996, 3(6), 393 - 404 y Kong-Beltram et al., Cancer Cell, 2004, 6(1), 75 - 84, que conduce al desarrollo de una diversidad de inhibidores de Met/HGF. Éstos incluyen compuestos de molécula pequeña que dirigen la actividad quinasa de Met, neutralizando los anticuerpos anti-Met o anti-HGF, receptores Decoy y factores derivados de HGF. No obstante, si tales moléculas se dirigen al sitio de unión de alta afinidad para HGF y cual es el mecanismo molecular exacto en base a la unión de HGF a Met con alta afinidad, permanece todavía desconocido. Esto puede evitar el aislamiento de agentes terapéuticos más selectivos, con sensibilidad aumentada y pocos efectos secundarios. El conocimiento exacto del sitio de unión de alta afinidad de Met para HGF ciertamente ayudará a diseñar antagonistas altamente específicos de Met. Sumario de la invención Por lo tanto se siente la necesidad de soluciones mejoradas que permitan la identificación de antagonistas Met con sensibilidad aumentada y pocos efectos secundarios para el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces para el tratamiento de cánceres. El objetivo de esta descripción es proporcionar tales soluciones mejoradas. De acuerdo con la presente invención tales objetivos se logran gracias a la solución que tiene las características mencionadas específicamente en las reivindicaciones siguientes. Las reivindicaciones forman parte integral en la enseñanza técnica en el presente documento proporcionada en relación con la presente invención. De este modo, el objetivo de la presente descripción es la identificación del sitio de unión de alta afinidad HGF al receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGFR), es decir, los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar medios para la identificación de antagonistas de HGFR que se dirijan el sitio de unión de alta afinidad de HGFR para HGF para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de cánceres. En una realización, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido constituido por, o un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección y / o desarrollo de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer, en particular un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. En una realización, el agente farmacológicamente activo es un inhibidor y / o antagonista del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos y se puede seleccionar entre inhibidores de moléculas pequeñas, aptámeros no codificantes, nucleótidos, inhibidores a base de ARN, ARNsi, anticuerpos, péptidos, factores negativos dominantes. En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la capacidad de un agente de ensayo para actuar como un antagonista/inhibidor del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos útil en el tratamiento de cáncer, preferiblemente un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer. 2. Uso de un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer. 3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente farmacológicamente activo interfiere con la actividad catalítica, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. 4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente farmacológicamente activo regula por disminución la actividad catalítica, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. 5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente farmacológicamente activo es un inhibidor y / o antagonista del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. 6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente farmacológicamente activo se selecciona entre inhibidores de moléculas pequeñas, aptámeros, nucleótidos no codificantes, inhibidores a base de ARN, ARNsi, anticuerpos, péptidos, negativos dominantes. 7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cáncer es un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. 8. Un procedimiento para detectar la capacidad de un agente de ensayo para actuar como un antagonista/inhibidor del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos útil en el tratamiento de cáncer, preferiblemente un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente de ensayo con i) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, ii) un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, o iii) células que expresan los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4, la hélice transmembrana y la región citoplásmica completa del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, (b) medir la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, y (c) seleccionar el agente que reduce la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha medición de en la etapa b) comprende medir la señalización de las células, supervivencia celular, y proliferación celular. 10. Los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para uso como un medicamento para tratamiento de cáncer. 11. Vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para uso como un medicamento para tratamiento de cáncer. 67   68   69     71   72   73