Un ácido nucleico aislado que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicho ácido nucleico,

cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a genes de resistencia, a construcciones de ADN, a microorganismos, a células vegetales y a plantas que contienen dichos genes de resistencia. Además, la invención se refiere a plantas genéticamente transformadas que son resistentes frente a plagas de plantas. Además, la solicitud 5 describe sondas y cebadores para la identificación de los genes de resistencia y kits de diagnóstico que contienen dichas sondas y/o cebadores. Finalmente, la invención se refiere a polipéptidos codificados por dichos genes de resistencia y a la utilización de dichos polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los patógenos de las plantas son responsables de pérdidas sustanciales de plantas y productos 10 vegetales debido a la infección de la planta. Las enfermedades de las plantas, como resultado de la infección por patógenos o plagas de las plantas, ocasionan daño a las plantas y/o a los productos vegetales, reducen la producción y el rendimiento, limitan el tipo de plantas que pueden desarrollarse en ciertas áreas geográficas y como resultado ocasionan graves pérdidas (financieras) al agricultor.

Los nematodos parásitos de plantas existen en todo el mundo y la mayoría de ellos vive durante 15 casi toda su vida en la capa superior de la tierra. Aunque se considera que las pérdidas ocasionadas por la alimentación directa de los nematodos de las raíces de las plantas son de pequeña importancia, varias especies, entre ellas los nematodos de los nudos de las raíces que pertenecen a la especie Meloidogyne, los nematodos de los quistes que pertenecen a la especie Heterodera y a la especie Globodera y otros nematodos tales como la especie Nacobbus, ocasionan un grave daño y pérdidas económicas en los cultivos. Los nematodos de los nudos de las raíces existen también en todo 20 el mundo pero se encuentran más frecuentemente y en mayor número en áreas con climas más cálidos y en invernaderos. Las especies más importantes de Meloidogyne son M. incognita, M. arenaria, M. hapla y M. javanica, de las cuales M. hapla se da también en zonas climáticas más templadas.

Existen diferentes medios para controlar los patógenos de las plantas, tales como el cultivo mecánico del suelo, el tratamiento químico con pesticidas, incluyendo nematicidas e insecticidas, o la rotación de cultivos. Sin embargo, para ciertos patógenos de las plantas, especialmente nematodos, estos medios de control son insuficientes para proteger a las plantas de la infección y las enfermedades resultantes. El único medio de control eficaz implica la resistencia de la planta huésped (Russell, 1978, Plant Breeding for pest and disease resistance, Butterworths edit., pág. 485). El desarrollo de cultivos resistentes a los patógenos comunes de las plantas es uno de los principales objetivos de los agricultores hoy en día, con el fin de reducir o finalmente eliminar la considerable necesidad de 30 pesticidas. La carga para el medio ambiente de grandes cantidades de pesticidas inyectados en el suelo o pulverizados sobre los cultivos, árboles, etc., en todo el mundo, resulta cada año más grave. Además, las normas gubernamentales en los países occidentales restringen el uso o incluso prohíben la utilización de ciertos pesticidas. Por lo tanto, la necesidad de plantas que sean resistentes a uno o más de sus patógenos, o que tengan una susceptibilidad reducida a sus atacantes resulta cada vez más urgente. El desarrollo de plantas resistentes es uno de los objetivos importantes de los 35 programas actuales de cultivo de plantas. Los genotipos de plantas susceptibles a patógenos particulares son cruzados con genotipos de plantas resistentes con el fin de introducir el fenotipo resistente en la línea de reproducción.

El daño causado por los nematodos de los nudos de las raíces resulta principalmente de la invasión de las raíces de la planta por larvas, las cuales en una relación compatible con la planta se desarrollan para dar lugar a una hembra reproductora. Después de la invasión, las larvas hacen que las células de las raíces se desarrollen 40 para dar células gigantes de las cuales se alimentan. Después de la infección se forman agallas o nudos en las raíces y las raíces de la planta resultan por otra parte alteradas, se engrosan y atrofian. El sistema de las raíces no funciona bien por tanto para captar el agua y los elementos nutricionales, lo cual daña el crecimiento y desarrollo de la planta. Frecuentemente, el daño a las plantas infectadas es incrementado por hongos parásitos que atacan al tejido de la raíz debilitado. Las plantas infectadas muestran un crecimiento reducido y hojas de color pálido más pequeñas, con frutos 45 diminutos de poca calidad o incluso sin frutos, y tienden a marchitarse en los climas más cálidos (Agrios, 1988, en: Plant Pathology, Academic Press, Inc.). El daño y/o la reducción del rendimiento ocasionados por los nematodos de los nudos de las raíces es considerable en la producción agrícola total mundial. En una plantación individual las pérdidas de producción pueden ser tan elevadas como del 25-50%, o incluso el cultivo puede ser aniquilado.

Los nematodos de los nudos de las raíces de los invernaderos pueden ser controlados mediante 50 esterilización por vapor del suelo o mediante la fumigación del suelo con nematicidas. Bajo condiciones de campo, el control puede lograrse mediante la utilización de nematicidas. Sin embargo, el uso de tales productos químicos, en algunos casos muy persistentes, está siendo cada vez más debatido y en algunos países está incluso prohibido el uso de ciertos nematicidas.

La producción de genotipos genéticamente resistentes es la forma más fiable y eficaz para 55 controlar la enfermedad de los nudos de las raíces. Se ha descrito para varias especies de cultivo la disponibilidad de resistencia dentro del plasma germinal relacionado, por ejemplo, patata, algodón, tabaco, trigo, soja, tomate, berenjena, frijol común y alfalfa. La producción de resistencia está dificultada primeramente por la existencia limitada de genes de resistencia (conocidos) en el plasma germinal disponible; en segundo lugar, en algunas especies de plantas, la existencia de barreras de cruce entre la especie de planta cultivada y la especie relacionada portadora de resistencia, y en tercer 60

lugar, los ensayos para seleccionar resistencia frente a susceptibilidad a nematodos son laboriosos y por lo regular no fiables. Por lo tanto, la producción de resistencia es muy difícil de conseguir o no se consigue, o si es posible, requiere mucho tiempo.

La introducción con éxito de genes de resistencia se ha logrado en el tomate. El gen de resistencia Mi (Meloidogyne incognita) ha sido introducido en tomates cultivados, Lycopersicon esculentum, después del cruce con 5 la especie salvaje relacionada L. peruvianum (PI 128657), utilizando un cultivo de embriones. El gen Mi confiere resistencia a varias especies de Meloidogyne (Fassuliotis, 1991, en: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se ha descrito que el gen de resistencia Mi es un gen dominante monogénico (Gilbert y McGuire, 1956, Proc. Am. Soc. Hortic. Sci., 68, 437-442), y está ubicado en el cromosoma 6 del tomate. También se postula que la región introgresada que comprende el locus Mi está involucrada en la concesión de resistencia al áfido de la patata 10 (Macrosiphum euphorbia) (Kaloshian y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622-625).

Las plantas han desarrollado un mecanismo complejo de defensa frente al ataque y la infección por patógenos. Hasta la fecha, el mecanismo exacto de su sistema de defensa aún no ha sido averiguado.

La resistencia a nematodos en el tomate se expresa después de la penetración. Una vez que la larva juvenil entra en la raíz y se establece en un sitio de alimentación, se desencadena una reacción hipersensible (HR) 15 adyacente a la cabeza del nematodo que tiene como resultado la muerte local de las células del huésped. El nematodo también es afectado adversamente por esta HR y muere (Fassuliotis, 1991, en: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se desconoce si existe o no un sentido de relación gen por gen (Flor, 1956, Adv. Gen., 8, 29-54) como es frecuentemente el caso en otras relaciones planta-patógeno en las que la resistencia se basa en la incompatibilidad de HR. 20

El aislamiento de genes vegetales sin conocer sus productos génicos es muy laborioso y difícil, debido a los enormes tamaños del genoma de las especies vegetales: por ejemplo, el tomate tiene un tamaño... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicho ácido nucleico, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que es capaz, cuando es transferido a una planta huésped que es susceptible a una plaga vegetal, de convertir dicha planta huésped en resistente a dicha plaga vegetal. 5

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que, que cuando es transferido a una planta huésped, es capaz de convertirla en resistente a insectos.

4. Un ácido nucleico aislado que es capaz de, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal, donde dicho ácido nucleico es un ADN homólogo que tiene al menos un 50% de identidad con una secuencia que comienza en la posición 10 nucleotídica 3263 y termina en la posición nucleotídica 7111 de la secuencia de la Figura 5.

5. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que tiene al menos un 50% de identidad con el inserto genómico presente en el plásmido pKGMi-11, estando depositado dicho plásmido pKGMi-11 en la Centraal Bureau Voor Schimmelkultures en Baam, Países Bajos, bajo el Número de depósito CBS822.96.

6. Una construcción de ADN recombinante que contiene un ácido nucleico de acuerdo con 15 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 6 que contiene un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho ácido nucleico está bajo el control de un promotor que es funcional en una célula vegetal, siendo dicho promotor endógeno o exógeno para dicha célula vegetal, y eficaz para controlar la transcripción de dicha secuencia de ADN en tales células vegetales. 20

8. Una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 7, en la cual dicho promotor es una secuencia promotora situada 5' corriente arriba del nucleótido 3263 según se proporciona en la Figura 5, o cualquier secuencia de ADN homóloga que tenga al menos un 50% de identidad con dicha secuencia promotora y contenga las secuencias reguladoras requeridas para la transcripción de la secuencia codificadora adyacente.

9. Un vector adecuado para transformar células vegetales, conteniendo dicho vector una 25 construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Células bacterianas que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Células vegetales que contienen una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

12. Una planta que contiene células vegetales de acuerdo con la reivindicación 11. 30

13. Una planta de acuerdo con la reivindicación 12 que tiene una susceptibilidad a insectos reducida.

14. Una semilla que contiene una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

15. Un proceso para obtener plantas con susceptibilidad reducida a una plaga vegetal, que comprende las etapas siguientes:

i) la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8,

ii) la obtención de células vegetales transformadas,

iii) la regeneración de plantas transformadas genéticamente a partir de dichas células vegetales transformadas, y 40

iv) opcionalmente, la propagación de dichas plantas.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicha plaga vegetal es un insecto.

17. Un proceso para proteger las plantas en cultivo frente a una infección por una plaga vegetal, que comprende:

i) la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8,

ii) la obtención de plantas transformadas, y

iii) el cultivo de dichas plantas transformadas.

18. Un polipéptido que es el producto de expresión de un ácido nucleico o de un ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de proteínas de la Figura 7A.

19. Un ARN aislado que tiene una secuencia de ácido ribonucleico de un transcrito de la secuencia de ADN de la reivindicación 1 ó 2. 5