REPARACIÓN DE CÉLULAS PARA LA PRODUCCIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO.

Preparación de células para la producción de material biológico El presente invento tiene que ver con un método para la preparación de células para usar en la producción de material biológico. Para la producción de material biológico, por ejemplo líneas celulares, se necesitará la preparación de cantidades grandes de células usando un procedimiento de escalado en bioreactores. El documento de patente norteamericana Nº 5.017.490 describe tal procedimiento de escalado que proporciona en particular la ventaja de un bajo riesgo de contaminación por transferencia. Este método no es, sin embargo, adecuado para células dependientes de anclaje (de ahí que, no sea para células que sólo crecen si están fijadas a un sustrato) o células embebidas en un sustrato (por ejemplo vehículos porosos). El documento de patente norteamericana Nº 4.644.912 describe un método para la preparación de células dependientes de anclaje para la producción de material biológico (es decir, virus) comenzando con una semilla de células de trabajo, y con subsiguientes pases efectuados en volúmenes crecientes consecutivos de bioreactores de 1 litro, 5 litros, 25 litros, 150 litros, y finalmente bien en un bioreactor de 1000 litros o en reactores múltiplos de 150 litros. Entre cualquiera de estas etapas de pases las células fueron liberadas de sus vehículos con una disolución de proteasa diluida. En el pase final la inoculación por virus fue efectuada. La solicitud de patente internacional WO 97/37000 describe células animales que pueden ser infectadas por virus de la gripe y que se adaptan a crecer en suspensión en un medio sin suero, y a procedimientos para la replicación de virus de la gripe en cultivos celulares usando estas células. Asumiendo tiempos de ciclo celular promedio de alrededor de 20 a 24 horas los intervalos de pases pueden ser de alrededor de 3-5 días. Por lo tanto, para expandir las células a cultivos lo suficientemente grandes a partir de un MWCS (MWCS =banco de células de trabajo del fabricante) el procedimiento total de escalado puede llevar varias semanas, dependiendo del volumen del bioreactor final. En los métodos anteriores para la preparación de células cada uno de los lotes de producción finales tiene que ser preparado a partir de MWCS. Para la producción de grandes cantidades de material biológico será necesario utilizar varias líneas de cultivo en paralelo hasta los volúmenes del recipiente más grande. Tal procedimiento de preparación, por consiguiente, consume mucho tiempo y necesita la operación de un número muy considerable de bioreactores para la preparación de las células así como para la producción de material biológico. Es un objeto del presente invento proporcionar una producción más rápida en la preparación de células para la producción de material biológico. Por consiguiente, el presente invento se refiere a un método para la preparación de células para usar en la producción de material biológico, cultivando células hasta un volumen celular deseado de un lote de preproducción, en el que después en un proceso discontinuo repetitivo: parte de las células del lote de preproducción es usada para la preparación de al menos un lote de preproducción, y la parte restante de las células del lote de preproducción es usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente, y las células de los lotes de producción se usan para la producción de material biológico, en donde un primer lote de preproducción se prepara a partir de patrón de semilla de trabajo mediante al menos una etapa de pases. Más en particular, el presente invento se refiere a dicho método para la preparación de células para usar en la producción de material biológico, cultivando células hasta un volumen celular deseado de un lote de preproducción , en el que después en un proceso discontinuo repetitivo: parte de las células del lote de preproducción es transferida para ser usada para la preparación de al menos un lote de preproducción, y la parte restante de las células del lote de preproducción es transferida para ser usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente. Según el presente invento el primer lote de preproducción es preparado a partir de un patrón de semilla de trabajo mediante al menos una etapa de pases. En una realización adicional preferida del presente invento las células que son preparadas son dependientes de anclaje. En el último caso generalmente será necesario que las células sean hechas crecer sobre un sustrato. Será entonces recomendable durante el proceso repetido cada vez cuando parte del lote es usado para la preparación de 2 ES 2 365 631 T3 un nuevo lote añadir una cantidad adicional de sustrato. En una realización preferida, cada tiempo previo a la adición de sustrato al menos parte de las células son primero liberadas de sus sustrato original. Como se usa aquí la expresión producción en lotes significa un cultivo de células que es empleado para la producción de material biológico. Como se usa aquí, la expresión preproducción en lotes significa un cultivo de células que es usado en el proceso según el presente invento para la preparación de al menos un lote de producción (como se define anteriormente) y un lote de preproducción en lote subsiguiente. Como se usa aquí la expresión material biológico significa cualquier sustancia u organismo que puede ser producido a partir de un cultivo celular. Ejemplos de material biológico son virus y proteínas tales como enzimas. Como se usa aquí la expresión patrón de semillas de trabajo significa una cantidad de cierto tipo de células de ancestros definidos almacenadas para ser usadas como una semilla a partir de la que todos los cultivos del mismo tipo de células son derivados. Como se usa aquí la expresión células dependientes de anclaje significa células que para su propio crecimiento y/o propagación necesitan estar unidas a un sustrato como se define aquí. Como se usa aquí la expresión sustrato significa cualquier materia particulada útil para la unión de células. Como se usa aquí la expresión etapa de pases significa una secuencia de actividades en la propagación y producción de células que comprenden al menos la transferencia de una cantidad adecuada de células y de una cantidad adecuada de medios de cultivo en un recipiente de producción, la incubación del recipiente en condiciones adecuadas para el crecimiento y propagación de las células durante un tiempo suficiente para el crecimiento eficaz y propagación de las células. Opcionalmente una etapa de pases puede comprender la separación de las células a partir del medio de cultivo y/o del sustrato después de un tiempo suficiente para el crecimiento eficaz y propagación de las células. Quedará claro para el profesional experto en la técnica que el método según el presente invento difiere esencialmente de los métodos conocidos en la técnica en los que las células son producidas en un proceso continuo más que en el proceso discontinuo presente. Según las publicaciones de patentes EP0417531 y WO89/08701 los sistemas de cultivo continuos pueden ser empleados también para la producción de virus. Primero las células son hechas crecer en un primer bioreactor, y después de que se ha alcanzado una cierta densidad celular son alimentadas de modo continuo desde dicho primer bioreactor a un segundo bioreactor. En este segundo bioreactor los virus son hechos crecer sobre células y subsiguientemente estos virus son retirados de modo continuo a partir de este segundo bioreactor. El método básico de trabajo según el presente invento es usar un bioreactor madre desde el que el/los bioreactor/es de producción es/son alimentado/s con células. Cuando las células son dependientes de anclaje, después de cada etapa de pases las células necesitan preferiblemente ser liberadas de sus sustratos. Un procedimiento de tripsinización sobre grandes bioreactores ha sido desarrollado para este propósito. Las células de producción son definidas hasta un número de pases específico y característico para el así llamado ECB (ECB= Banco de células extendido). El método descrito permite una producción de alto rendimiento puesto que la ruta de escalado desde WCS hasta las células de producción puede ser acortado en gran medida y muchos menos bioreactores son necesarios puesto que las líneas de producción en paralelo ya no son necesarias. Varias realizaciones del presente invento son descritas en la Figura 1. En una realización preferida las células son expandidas de una ampolla de un MWCS hasta el nivel del primer lote de preproducción a través de una o más etapas de pases. El tamaño del bioreactor usado para tal lote de preproducción puede oscilar desde varios litros de volumen de trabajo hasta... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de material biológico, en el que las células se cultivan hasta un volumen de células deseado de un lote de preproducción, en el que después en un proceso discontinuo repetido: a) parte de las células del lote de preproducción son usadas para la preparación de al menos un lote de producción, y b) la parte restante de las células del lote de preproducción es usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente, y las células de los lotes de producción se usan para la producción de material biológico, en donde un primer lote de preproducción se prepara a partir de patrón de semilla de trabajo mediante al menos una etapa de pases. 2. El método según la reivindicación 1, en el que en el proceso discontinuo repetido: a) parte de las células del lote de preproducción es transferido para ser usado para la preparación de al menos un lote de preproducción, y b) la parte restante de las células del lote de preproducción es transferido para ser usado como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente. 3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que las células son células dependientes de anclaje, las cuales para su crecimiento y/o propagación necesitan estar unidas a un sustrato. 4. El método según la reivindicación 2, en el que las células son células dependientes de anclaje que para su crecimiento y/o propagación necesitan estar unidas a un sustrato, las células se cultivan sobre dicho sustrato, y antes de cada etapa de transferencia las células se liberan de dicho sustrato. 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las células son células MDCK. 6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el material biológico producido es un virus. 7. El método según la reivindicación 6, en el que el virus que se ha de producir se añade al lote de producción para comenzar la producción de virus. 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el material biológico producido es una proteína. 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el número de pases de cada lote de producción está entre el banco de células principal y el banco de células extendido. 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las especificaciones de las células de cada lote de producción se validan para que sean similares a las del banco de células principal. 8 ES 2 365 631 T3 9