REACTIVO PARA MEDIR EL TIEMPO DE COAGULACIÓN Y PROCEDIMIENTO PARA FABRICAR EL REACTIVO.

Reactivo para medir el tiempo de coagulación y procedimiento para fabricar el reactivo. Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere a un reactivo para la prueba de coagulación usada al investigar el sistema de coagulación extrínseco de la sangre y a un procedimiento para fabricar el reactivo. 2. Descripción de la técnica relacionada La tromboplastina es un complejo entre una proteína denominada factor tisular y un fosfolípido. La tromboplastina está implicada en la coagulación de la sangre. Por tanto, la tromboplastina se ha usado en varias pruebas de coagulación. Por ejemplo, un reactivo para una prueba de tromboplastina para el análisis completo de la capacidad de coagulación de los factores II, VII y X (o los factores II, VII, IX y X) en sangre contiene tromboplastina de tejido cerebral bovino, fibrinógeno, factor V, calcio y fosfolípido. La tromboplastina de tejido cerebral bovino como componente mayoritario del reactivo para la prueba de trombos es un complejo de fosfolípido añadido a una proteína denominada factor tisular. El factor tisular es una proteína que consiste en 257 aminoácidos en total, como se muestra en la Fig. 3 en Yuko Takayenoki y col.: "cDNA and amino acid sequences of bovine tissue factor", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 181, 1991, páginas 1145-1150. El factor tisular consiste en un dominio extracelular (dominio soluble) desde el extremo N al aminoácido 213, un dominio transmembrana desde el aminoácido 214 al aminoácido 236 y un dominio intracelular desde el aminoácido 237 al aminoácido 257. Convencionalmente, la tromboplastina que tiene dicha constitución se ha producido extrayendo tromboplastina de un cerebro bovino como material de partida con polvo de acetona o solución fisiológica salina. Un cerebro bovino usado como material de partida es uno muy afectado por la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Por tanto, recientemente se ha producido una demanda de un procedimiento de fabricación que no use un cerebro bovino como material de partida. Existen informes sobre la fabricación, usando técnicas de ingeniería genética, de un factor tisular recombinante que tiene actividad como composición de un reactivo de medición. Ejemplos de dichos informes incluyen los documentos WO 93/07492, WO 98/48283, y un texto de Cheryl L Brucatol y col. ("Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichia pstoris, and its application in a prothrombin time reagent", Protein Expression and Purification, Vol. 26, 2002, páginas 386-393). Específicamente, en el documento WO 93/07492 ant., un factor tisular humano recombinante se expresa en Escherichia coli. A continuación, el factor tisular humano recombinante se purifica mediante cromatografía de afinidad con un anticuerpo monoclonal inmovilizado frente al factor tisular humano. Después, el factor tisular humano recombinante purificado se aplica a un reactivo de protrombina. En el texto de Cheryl L Brucatol y col., un factor tisular recombinante de conejo (rTF) se expresa en levaduras. Después se usa una marca de histidina para purificar en rTF y el rTF resultante se aplica a un reactivo del tiempo de protrombina. En este texto, se da a conocer que el factor tisular de conejo expresado es un factor tisular de longitud completa que consiste en un dominio intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular. En el documento WO 98/48283, un factor tisular recombinante de conejo de longitud completa constituido por un dominio extracelular, un dominio unido a lípido y un dominio intracelular se expresa en levaduras. Después, para purificar el factor tisular recombinante de conejo se usa una marca de histidina que enriquece específicamente el factor tisular recombinante. A continuación, el factor tisular recombinante de conejo purificado se aplica a un reactivo del tiempo de protrombina. Los documentos WO 2006/096345 y US2006/0046309 describen los reactivos de tromboplastina que comprenden un factor tisular recombinante y un fosfolípido, en los que el factor tisular recombinante se purifica antes de su incorporación en el reactivo. Como se ha descrito anteriormente, se usa un factor tisular recombinante purificado mediante cromatografía etc. con el fin de prevenir la reducción de la actividad de coagulación de un reactivo o la reducción de la precisión de la medición causadas por contaminación del reactivo con impurezas derivadas del huésped. No obstante, para la purificación del factor tisular recombinante es necesario construir un sistema para separar de y eliminar forma eficiente las impurezas derivadas del huésped. Cuando el factor tisular recombinante se produce en grandes cantidades, la etapa de purificación requiere un tiempo trabajo y costes considerables y, por tanto, existe un problema de productividad del factor tisular recombinante. 2   En el procedimiento de purificación con cromatografía de afinidad con, por ejemplo, un anticuerpo específico, el uso del anticuerpo específico da lugar a mayores costes en la producción masiva. Por ejemplo, para el factor tisular recombinante de conejo, en la práctica se ha usado el procedimiento de purificación con cromatografía de afinidad con una marca de histidina como procedimiento de purificación adaptado a la producción masiva. No obstante, la relación entre una marca de histidina y el factor tisular recombinante puede afectar a la actividad de coagulación, dependiendo del tipo de huésped o del tipo de factor tisular. Por tanto, en este procedimiento de purificación se corta la marca de histidina después de la purificación. La adición de esta etapa de eliminación de la marca cortándola conduce a un incremento de los costes de producción. En función de la estructura estérica del factor tisular, el factor tisular puede no purificarse satisfactoriamente, incluso con cromatografía con una marca de histidina. A partir de lo anterior, debería construirse un sistema de producción que pueda satisfacer la productividad con respecto a los costes y la cantidad de producción sin afectar a la actividad de coagulación, para la producción del factor tisular mediante técnicas de ingeniería genética. Por tanto, se desea proporcionar un reactivo para medir el tiempo de coagulación usando un factor tisular obtenido mediante el sistema de producción construido. Sumario de la invención El alcance de la presente invención sólo se define con las reivindicaciones adjuntas y no se ve afectado en ninguna medida por las afirmaciones de este sumario. En un primer aspecto de la presente invención hay un reactivo para medir el tiempo de coagulación, que comprende: Un complejo de un fosfolípido y un factor tisular recombinante obtenido usando un insecto o una célula cultivada de insecto como huésped; y un componente soluble derivado del insecto o de la célula de insecto cultivada. En un segundo aspecto de la presente invención, un procedimiento para fabricar un reactivo para medir el tiempo de coagulación, que comprende las etapas de: Infectar un insecto o una célula cultivada de insecto con un baculovirus recombinante obtenido integrando el ADNc del factor tisular en ADN de baculovirus; expresar un factor tisular recombinante codificado por el ADNc en el insecto o célula cultivada de insecto; preparar una composición soluble que contiene el factor tisular recombinante eliminando los materiales insolubles de una solución que contiene materiales rotos obtenidos rompiendo el insecto o la célula cultivada de insecto que ha expresado el factor tisular recombinante; y formar un complejo del factor tisular recombinante y un fosfolípido mezclando la composición soluble con el fosfolípido. Descripción breve de las figuras La Fig. 1 muestra los resultados de SDS-PAGE de una solución SW que contiene factor tisular recombinante bovino. La Fig. 2 muestra los resultados de una SDS-PAGE de una solución SF que contiene factor tisular recombinante bovino. La Figura 3 es un gráfico que muestra la relación entre la actividad de un reactivo control I y la actividad de un reactivo SW. La Figura 4 es un gráfico que muestra la relación entre la actividad de un reactivo control I y la actividad de un reactivo SF. La Figura 5 es un gráfico que muestra la relación entre la proporción de dilución del plasma y el tiempo de coagulación en la medición usando un reactivo para la prueba de sensibilidad PIVKA preparada en el Ejemplo 4. Descripción de las realizaciones preferidas El reactivo para medir el tiempo de coagulación en una realización de la invención comprende un complejo de un fosfolípido y un factor tisular recombinante obtenido usando un insecto o una célula cultivada de insecto como huésped; y un componente soluble derivado del insecto o de la célula de insecto cultivada. El reactivo para medir el tiempo de coagulación contiene un factor tisular recombinante... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo para medir el tiempo de coagulación, que comprende: un complejo de un fosfolípido y un factor tisular recombinante obtenido usando un insecto o una célula cultivada de insecto como huésped; y un componente soluble derivado del insecto o de la célula de insecto cultivada. 2. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el factor tisular recombinante es un factor tisular recombinante bovino que tiene un dominio soluble y un dominio transmembrana. 3. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el factor tisular recombinante tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 1. 4. El reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el insecto es un insecto lepidóptero. 5. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el insecto lepidóptero es un gusano de seda. 6. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el componente soluble derivado del insecto o la célula de insecto cultivada comprende una proteína soluble derivada del insecto o la célula de insecto cultivada. 7. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el reactivo para medir el tiempo de coagulación es un reactivo para la prueba de trombos, un reactivo para la prueba de hepaplastina o un reactivo del tiempo de protrombina. 8. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en el factor I, factor V, plasma adsorbido sobre sulfato de bario y un ion calcio. 9. Un procedimiento para fabricar un reactivo para medir el tiempo de coagulación comprende las etapas de: infectar un insecto o una célula cultivada de insecto con un baculovirus recombinante obtenido integrando el ADNc del factor tisular en ADN de baculovirus; expresar un factor tisular recombinante codificado por el ADNc en el insecto o célula cultivada de insecto; preparar una composición soluble que contiene el factor tisular recombinante eliminando los materiales insolubles de una solución que contiene materiales rotos obtenidos rompiendo el insecto o la célula cultivada de insecto que ha expresado el factor tisular recombinante; y formar un complejo del factor tisular recombinante y un fosfolípido mezclando la composición soluble con el fosfolípido. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el ADNc codifica un dominio soluble y un dominio transmembrana del factor tisular bovino. 11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el ADNc codifica el factor tisular recombinante bovino que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la solución que contiene materiales desechos comprende un tensioactivo. 19     21   22   23