PRUEBA DE DIAGNÓSTICO PARA VAGINOSIS BACTERIANA.

Esta invención está relacionada con un método para la detección de vaginosis bacteriana. Se expone también un dispositivo para su uso en dicho método y un conjunto que comprende dicho dispositivo. La vaginosis bacteriana (VB) es un estado en el cual la mayor parte de los numerosos microorganismos que pueblan la vagina (Lactobacilli) son desplazados por otro microorganismo tal como la Gardnerella vaginalis. La VB está asociada con el parto pretérmino (PPT). El mecanismo responsable de esta asociación se piensa a que es debido a la flora relacionada con la VB que consigue el acceso al útero y que provoca la liberación de mediadores de inflamatorios que inician el parto. Se había pensado previamente que en la VB, la infección bacteriana en sí misma daba lugar al PPT. Los antibióticos se han utilizado comúnmente para el tratamiento de la VB, por ejemplo para prevenir el PPT, pero dicho tratamiento obtiene rara vez el éxito. Además, los antibióticos pueden eliminar las bacterias no patógenas, incluyendo las cepas beneficiosas tales como el Lactobacilli. En el momento actual, la presencia de la VB se detecta sobre la base de un examen clínico y por la tinción de Gram por la característica de las bacterias de la enfermedad. Se requieren unos pocos días con el fin de conseguir un resultado, utilizando la tinción de Gram, de forma que no se puede informar al paciente del resultado en el instante de la visita a la clínica. Durante el embarazo, no existe ninguna barrera membranosa entre la vagina y el útero para poder prevenir una infección bacteriana ascendente. No obstante, el tapón de moco cervical se cree que actúa como una barrera física en la infección intra-útero. El tapón de moco está construido sobre una infraestructura de glicoproteinas ricas en carbohidratos, denominadas mucinas. Las mucinas están compuestas por cadenas laterales de oligosacáridos unidas a un núcleo central de proteínas. Los residuos del ácido sialico están presentes en los extremos terminales de las cadenas laterales del carbohidrato. Los altos niveles de la actividad de la sialidasa bacteriana se han encontrado en las secreciones de la vagina de las mujeres con VB, en oposición a las mujeres sin VB (MacGregor y otros (1994) Am. J.Obstet. Gynaecol. 170 1048- 1060; Briselden y otros (1992) J. Clin. Microbiol. 30 663-666). Las sialidasas bacterianas son enzimas que se unen a los residuos del ácido siálico de los glicolipídos y glicoproteinas. Hasta la fecha actual, la actividad de la sialidasa se ha ensayado por técnicas de colorimetría, fluorimetría, y técnicas radioactivas utilizando una amplia variedad de substratos sialoglicoconjugados sintéticos. Los substratos que se han utilizado previamente en los ensayos de la actividad de la sialidasa incluyen: mucina de la glándula submandibular bovina y glicoproteina ácida -1 humana (Howe y otros (1999) en prensa); ácido 2-(4-metilumbeliferilo)--D-N-acetilo neuraminico (Paupermpoonsiri y otros (1996) Clin.Inf. Dis. Vol. 23 748-752; Brieselden y otros (1992) supra) Moncla y otros (1989) J. Clin. Microbiol, 27, 182-184; ácido 4-nitrofenilo- sialico, y ácido 2-(3metoxifenilo)-N-acetilo-D neuramínico (MacGregor y otros (1994) supra). La sensibilidad de muchos de los substratos de sialidasa conocidos es baja. Los substratos de sialidasa descritos hasta la fecha se utilizan en una amplia variedad de ensayos. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de colorimetría o fluorimétricos con substratos sintéticos, los cuales detectan la fracción no siálica del substrato (por ejemplo, 4-metil umbeliferona ó 4-nitrofenol). Alternativamente, la cantidad de ácido siálico liberado a partir de un substrato sialoglicoconjugado puede ser detectada por HPLC o un ensayo de colorimetría. Así mismo, los ensayos radioactivos se utilizan algunas veces, lo cual incluye la introducción de un radiomarcaje dentro del substrato sialoconjugado y la detección del ácido siálico liberado por el cómputo de centelleo líquido. Se ha descrito en el documento JP5339283 un método para preparar ácido 5-bromo-4-cloro-3indoilo -D-N-acetilo neuramínico, para su utilización en la recuperación de la enzima similar a la sialidasa. El documento WO00/24753 (disponible como una referencia bajo el Articulo 54(3) EPC)) describe unos materiales y metodos para el diseño, síntesis, y evaluación bioquímica de los compuestos de substratos cromogénicos para las sialidasas de origen bacteriano, viral, protozoito y vertebrado (incluyendo seres humanos). Se describe una clase de compuestos como los substratos cromogénicos de estas sialidasas, que generan productos cromogénicos después de las reacciones catalizadas por las sialidasas. Se describen también unos métodos de obtención de estos compuestos de los substratos, métodos de diagnosis y prognosis de sialidasa en relación con las enfermedades que utilizan estos compuestos de los substratos. Los presentes inventores han descubierto que la conexión entre PPT y VB es debido a la actividad de la sialidasa bacteriana, más bien que a la propia infección bacteriana. Se cree que la actividad de la sialidasa está incluida en la 2 E09166010 08-11-2011   degradación del tapón de moco, lo cual da lugar a un acceso bacteriano en incremento dentro del tracto reproductor superior. Los grupos carboxílicos de los ácidos siálicos en los extremos de las cadenas laterales de los carbohidratos de las moléculas de mucina confieren una carga iónica negativa, provocando rigidez en las cadenas laterales de azúcar. La unión del ácido siálico destruye la carga mutuamente repelente entre las moléculas de mucina, provocando una pérdida de viscosidad del tapón de moco. El acceso bacteriano al interior del tracto reproductor superior se incrementa como resultado de esta acción por dos razones. En primer lugar, la mucina y por tanto la organización de la matriz del moco se pierde después de la degradación, y las propiedades mecánicas y bacterioestáticas de la matriz del moco se convierten en menos efectivas como mecanismos de barrera. En segundo lugar, la desintegración de la capa del moco facilita la adherencia bacteriana al epitelio subyacente, lo cual altera las respuestas del reconocimiento inmunológico, y reduce la probabilidad de que las bacterias puedan ser lavadas y eliminadas por el movimiento del fluido vaginal. Se deduce de este descubrimiento que los inhibidores de sialidasa tienen que ser útiles para tratar y prevenir condiciones tales como la vaginosis bacteriana, y serán útiles en terapias para prevenir PPT. Se deduce también que los ensayos de la actividad de la sialidasa serán útiles para detectar enfermedades tales como la VB. Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de diagnóstico para enfermedades tales como la VB, que detecta la presencia de actividad de la sialidasa. Un resultado de este ensayo ha encontrado la correlación significativa con la incidencia de VB utilizando la diagnosis convencional de la tinción de Gram. El método del ensayo incluye la toma de una muestra en el paciente y poner en contacto la muestra con el substrato de sialidasa. Después de la incubación, se observa un cambio detectable tal como un cambio del color en caso de detectar la actividad de la sialidasa. En una realización preferida, el ensayo es un ensayo rápido (o test spot), es decir que la muestra se aplica al substrato de sialidasa, el cual está soportado en sí por un medio sólido adecuado, tal como un papel de filtro. El ensayo hace uso de substratos en los que se ha encontrado una sensibilidad muy alta en la detección de la VB, indicado posiblemente un entorno óptimo para la unión de sialidasas a partir de la flora de la VB. El substrato utilizado en el presente ensayo es una sal de ácido neuramínico 5-bromo-4-cloro-3-indoil -D-N-acetilo, en particular el ciclohexilamina (X--NAMA), que se encuentra disponible a través de Rose Scientific Ltd., Edmonton, Canadá. El método del ensayo de la presente invención para detectar la actividad de la sialidasa es altamente sensible, de bajo costo de ejecución rápido y sencillo de utilizar. El ensayo es especialmente útil para la prueba de la actividad de la sialidasa como un indicador de la VB, y por tanto un predictor de la probabilidad de nacimiento pretérmino. El ensayo puede llevarse a cabo en la misma sala del paciente o bien una clínica general o de cirugía menor, puesto que el método de la invención no requiere el uso de unidades de equipamiento costoso o bien materiales distintos a los que están disponibles normalmente. Por ejemplo, en contraste con los métodos convencionales, no hay necesidad de un equipo de tinción de Gram o bien un microscopio básico. Además de ello, el método de la invención exige menos trabajo que una tinción de Gram. Así mismo, el ensayo rápido (spot) de sialidasa tiene una ventaja sobre las pruebas de colorimetría,... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico de la vaginosis bacteriana que comprende la detección de la actividad de la sialidasa en una muestra, cuyo método comprende las etapas siguientes: (a) contactar la mencionada muestra con un reactivo de prueba que comprenda el acido neuramico acetilo 5- bromo-4-cloro-3 indolyl -D-N o bien una sal del mismo; y (b) detectar un cambio en el reactivo de prueba. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cambio detectado es un cambio de color. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cambio de color es del incoloro al azul. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el cambio de color se detecta visualmente. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el cambio de color se detecta utilizando un equipamiento adecuado para detectar el cambio del color. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el equipamiento es un colorímetro de tiras o bien un espectrofotómetro. 7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra es una muestra biológica obtenida de un sujeto humano. 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la muestra es un tampón de algodón vaginal o un lavado. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la muestra es un tampón de algodón vaginal y en donde los contenidos del algodón vaginal son extraídos en un medio liquido antes de contactar con la prueba. 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el medio líquido es una solución tampón Tris. 11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la sal del acido neuramico 5-bromo- 4-cloro-3-indolyl -D-N-acetilo es una sal de ciclohexilamina 6 E09166010 08-11-2011