PROTEÍNAS ESTABILIZADAS.

La presente invención se refiere a métodos de entrecruzamiento para estabilizar polipéptidos y complejos de polipéptido para usos comerciales (farmacéutico, terapéutico, y industrial), y a polipéptidos y complejos de polipéptido así entrecruzados. 2. Antecedentes de la invención 2.1. Estructura y función de los polipéptidos y complejos de polipéptido Una molécula de proteína consiste en una cadena de polipéptido lineal de aminoácidos que se pliega en forma compleja en tres dimensiones para formar, por ejemplo, superficies de interacción, bolsillos de unión y sitios activos. De manera general se requiere un plegado tridimensional específico para la función de la proteína, en donde el plegado en sí mismo se especifica por la secuencia lineal de aminoácidos (es decir, la estructura principal de la proteína). Es notable, sin embargo, que estructuras principales diferentes puedan tener plegados tridimensionales casi idénticos. La evolución ha conservado plegados específicos a un grado mayor que las estructuras principales específicas. En los procesos de plegado de proteína sigue abierto un campo activo de estudio. Se sabe, sin embargo, que los elementos de estructura secundarios tal como hélices alfa, láminas beta y giros beta contribuyen al ensamble de la estructura terciaria de un polipéptido. Se dice que una entidad de proteína biológica hecha de varios polipéptidos tiene estructura cuaternaria. El plegado de una proteína finalmente resulta de la interacción de fuerzas intra e intermoleculares. Como tal, una proteína plegada tiene una estabilidad finita que se traduce en una "vida útil" estructural y funcional finita en un ambiente de solvente dado. Por ejemplo, en un ambiente acuoso, las proteínas logran estabilidad en parte al agrupar los residuos hidrófobos en el núcleo de proteína y los residuos hidrófilos en la interfaz de proteína-solvente. De acuerdo con lo anterior, la vida útil de actividad para una proteína dada es en parte una función de las propiedades del solvente. Adicionalmente, los enlaces químicos tales como disulfuros ocurren en la naturaleza para fijar la coordinación de las cadenas laterales no vecinas en proximidad cercada a una proteína plegada, estabilizando por lo tanto su estructura y su función. En muchos sistemas biológicos, las proteínas se asocian una a la otra para formar dímeros o multímeros de orden mayor (es decir estructuras cuaternarias), y solo como tales llevan a cabo sus funciones específicas. La formación de tales complejos es frecuentemente un evento importante en la regulación de la actividad de las proteínas. Se han encontrado diversos mecanismos para regular la formación del complejo de proteína, tales como la unión de ligando o la modificación post-translacionales. Las funciones de los complejos de proteína pueden variar desde proveer estructura a la matriz intracelular, en donde, por ejemplo, la actina forma una red estructural, hasta factores de transcripción. Las proteínas consisten de dominios funcionales discretos. Los dominios de la función análoga o similar en diferentes proteínas muestran usualmente las similitudes de la secuencia de aminoácidos y se relacionan con la evolución. El "barajado de dominios" ha jugado una función principal en la evolución (así como también en la ingeniería genética) de las proteínas con funcionalidades altamente diversas. Los dominios de interacción, por ejemplo, se pueden encontrar en las proteínas de muchas diferentes funciones; sin embargo, las similitudes de secuencia revelan su presencia. Los estudios cristolográficos han mostrado que los dominios relacionados son aún más conservados en la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria en la secuencia de aminoácidos primaria, de tal manera que las inferencias estructurales se pueden hacer acerca de un dominio particular si los datos estructurales están disponibles en uno o preferiblemente múltiples dominios relacionados (ver por ejemplo, Hofmann K., Cell Mol. Life Sci. vol. 55(8-9): pp. 1113-28, 1999; Chou J.J. et al., Cell vol. 94(2): pp. 171-80, 1998). 2.2. Enzimas biocatalíticas ES 2 367 475 T3 Existen numerosas aplicaciones comerciales concebibles de las proteínas estabilizadas, complejos de proteína e interacciones proteína-proteína. Como un ejemplo de una clase de proteínas para las que es deseable la estabilización, se consideran en esta sección enzimas y otras proteínas que se han utilizado como biocatalizadores en aplicaciones industriales. también se considera la evaluación del mercado de enzimas biocatalíticas. Los procesos biocatalíticos industriales tienen uso en muchos sectores industriales, que incluyen las industrias química, de detergentes, farmacéutica, agrícola, de alimentos, cosméticos, textiles, procesamiento de materiales, y de papel. Dentro de estas industrias, los biocatalizadores tienen muchas aplicaciones, que varían desde la síntesis de producto (por ejemplo, fabricación de aminoácidos), uso como agentes activos en ciertos productos (por ejemplo, 2 polvos de lavado biológico), uso en equipos de pruebas de diagnóstico, y uso como agentes terapéuticos. Las ventas totales de biocatalizadores industriales en 1999 fueron de alrededor de $1.4 miles de millones. Se espera que esta figura crezca significativamente durante la siguiente década cuando se habiliten aplicaciones de biocatalizadores mediante tecnologías novedosas tal como la invención descrita aquí. Se cree que los sectores comerciales que tienen potencial de crecimiento e innovación tecnológica incluyen enzimas diseñadas por ingeniería (por ejemplo, para proporcionar rendimiento más rápido, producción más barata, y/o la capacidad de producir productos novedosos), sistemas de control de la polución (por ejemplo, para biorremediación), y sistemas biocatalíticos no acuosos (por ejemplo, para bioprocesamiento de grasas y aceites y fabricación de fármacos) (véase Business Intelligence Center, Explorer: "BIC Explorer"; Business Opportunities in Technology Commercialization). Históricamente, solo un puñado de las compañías de productos químicos finos tal como DSM, Lonza y Avecia Ltd., han abordado e invertido en los procesos biocatalíticos. Más recientemente, sin embargo, ha habido varias inversiones corporativas significativas en el campo de los biocatalizadores. Un ejemplo de tales inversiones es el anuncio reciente de Bayer de que utilizará 6-7% de las ventas de productos químicos para desarrollar procesos basados en enzimas para ciertas moléculas. Los clientes principales de las compañías de química fina tienden a preferir proveedores con un amplio rango de desarrollo de procesos. Esta consideración sugiere que aquellos con experiencia en biocatalítica pueden obtener una ventaja más competitiva en el mercado. Algunas firmas han reconocido esto y tratan rápidamente de cerrar la brecha por medio de adquisiciones (por ejemplo la adquisición por Great Lakes de NSC Technologies y la compra por Cambrex de Celgene). Otros reconocen que van a perder nuevas oportunidades de negocio si no hacen algo para acceder a los conocimientos básico necesarios para la biocatálisis (Joe Blanchard, Altus Biologics Inc., 1999). Los principales fabricantes de enzimas (por ejemplo Novo, Genencor, Roche, etc.) tienden a enfocarse en una producción de enzimas a gran escala para los mercados industriales principales (tal como detergentes y textiles) y no en la aplicación de enzimas para el desarrollo de productos químicos finos (Joe Blanchard, Altus Biologics Inc., 1999). El crecimiento continuo en interés por el uso comercial de los biocatalizadores y la fragmentación de la industria de los biocatalizadores permitirá a las compañías grandes y pequeñas explotar biocatalizadores innovadores y los productos y procesos que los utilizan (BIC Explorer: Business Opportunities in Technology Commercialization, 1999). Las aplicaciones de biorremediación pueden, en el futuro, convertirse en una de las aplicaciones de mayor importancia económica de las enzimas biocatalíticas. Por ejemplo, aproximadamente 2.3 millones de millones de galones de aguas residuales y 4.9 miles de millones de galones de residuos industriales pasan a las aguas en los Estados Unidos cada año, y aproximadamente 1 millón de galones de hidrocarburos ingresan a nuestro ambiente por día. La limpieza de hidrocarburos es un requerimiento de rutina para diversas operaciones comerciales (por ejemplo, buques petroleros, sentinas marinas, tanques de almacenamiento, combustible y carrotanques). Actualmente, existen varios procesos en desarrollo que utilizan biocatalizadores para descontaminación/descomposición de hidrocarburos y aguas de desecho. No solo son estos procesos los sistemas más prometedores comercialmente debido a su eficiencia y bajos costes, sino que también son más limpios. Adicionalmente, la desulfurización... [Seguir leyendo]

1. Un método para elaborar una proteína estabilizada que comprende: (a) seleccionar uno o más pares de residuos en una cadena o cadenas de polipéptidos para entrecruzamiento: (b) sustituir por lo menos uno de los residuos seleccionados con tirosina dando como resultado que ambos residuos seleccionados son tirosina; y (c) entrecruzar los pares de residuos; en donde las proteínas entrecruzadas di-tirosina retienen por lo menos una actividad funcional desplegada por la proteína en la ausencia de entrecruzamiento de di-tirosina, y donde al menos una tirosina de un entrecruzamiento de di-tirosina es el resultado de una sustitución de aminoácido a tirosina. 2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la sustitución de por lo menos un residuo tirosina por un residuo de aminoácido que no se entrecruza bajo condiciones de entrecruzamiento. 3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la función retenida se selecciona del grupo que consiste en actividad catalítica y especificidad de unión. 4. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un factor de crecimiento, una hormona y un anticuerpo o fragmento funcional del mismo. 5. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde ocurre la reacción de entrecruzamiento en la presencia de un oxidante seleccionado del grupo que consiste en peróxido de hidrógeno, oxona, hexahidrato de ácido magnesio monoperoxiftálico (MMPP), un oxidante fotogenerado, y persulfato de amonio. 6. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el entrecruzamiento se cataliza mediante un catalizador seleccionado del grupo que consiste en polihistidina, Gly-Gly-His, una metaloporfirina, una peroxidasa, o cualquier combinación de las mismas. 71 ES 2 367 475 T3 72 CATALIZADOR + REACTIVOS DE OXIDACIÓN ES 2 367 475 T3 73 ES 2 367 475 T3 74 CADENA LIGERA FRAGMENTO FAB REGIÓN DE UNIÓN DE COMPLEMENTO REGIÓN DE RECLUTAMIENTO DE MACRÓFAGOS FRAGMENTO FV ES 2 367 475 T3 3 REGIONES DE DETERMINACIÓN DE COMPLEMENTARIEDAD CADENAS PESADAS FRAGMENTO Fc CADENA LIGERA 4 REGIONES DE ESTRUCTURA CARBONO ALFA LIBERTAD ROTACIONAL EN CARBONO BETA ESTRUCTURA PRINCIPAL DEL POLIPÉPTIDO ES 2 367 475 T3 CARBONO ALFA 76 LIBERTAD ROTACIONAL EN EL ENLACE DITIROSINA ESTRUCTURA PRINCIPAL DEL POLIPÉPTIDO ES 2 367 475 T3 77 ES 2 367 475 T3 78 CADENA LIGERA (L) K&W ES 2 367 475 T3 COORD. x 79 COORD. y COORD. z K&W ES 2 367 475 T3 COORD. x COORD. y COORD. z FRAGMENTO Fv 1 FRAGMENTO Fv 2 ES 2 367 475 T3 81 FRAGMENTO Fv 3 ES 2 367 475 T3 82 ES 2 367 475 T3 83 ES 2 367 475 T3 84 DISTANCIAS ALFA DISTANCIAS BETA ES 2 367 475 T3 DIFERENCIA ES 2 367 475 T3 DIFERENCIAS ENTRE LAS DISTANCIAS DE CARBONO ALFA Y BETA DEL PAR DE RESIDUOS 86 FRAGMENTO Fv 1 FRAGMENTO Fv 2 FRAGMENTO Fv 3 FRAGMENTO Fv 4 ES 2 367 475 T3 87 ES 2 367 475 T3 88 ES 2 367 475 T3 Aminoácido Hidrofobicidad volúmenes 89 ES 2 367 475 T3 DISPOSICIÓN EN PARALELO DISPOSICIÓN SUCESIVA FILTROS SEPARACIÓN DE CARBONO ALFA FLEXIBILIDAD DE CARBONOS ALFA ES 2 367 475 T3 ORIENTACIÓN DE CADENA LATERAL INTERSECCIÓN FLEXIBILIDAD DE CADENA LATERAL 91 CONSERVACIÓN DE RESIDUO DE AMINOÁCIDO PROPIEDADES FÍSICAS DE CADENA LATERAL