PROMOTORES INDUCIBLES POR CALOR DE TETRAHYMENA Y SU USO.

Promotor inducible por calor de la familia de proteínas de choque térmico del ciliado Tetrahymena thermophila,

según el cual el promotor tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1 o sus fragmentos eficaces como promotor

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/064244.

Solicitante: CILIAN AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: JOHANN-KRANE-WEG 42 48149 MÜNSTER ALEMANIA.

Inventor/es: HARTMANN, MARCUS, WEIDE,Thomas,c/o Cilian AG, HERRMANN,Lutz,c/o Cilian AG, NIEBUR,Nadine.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 13 de Julio de 2006.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/44 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de protozoos.

Clasificación PCT:

  • C12N15/85 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células animales.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2359512_T3.pdf

 

PROMOTORES INDUCIBLES POR CALOR DE TETRAHYMENA Y SU USO.
PROMOTORES INDUCIBLES POR CALOR DE TETRAHYMENA Y SU USO.
PROMOTORES INDUCIBLES POR CALOR DE TETRAHYMENA Y SU USO.

Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención aborda campos de la biología molecular recombinante; el tema principal son los promotores fuertes inducibles para uso en la síntesis de productos en sistemas biológicos.

Antecedentes de la invención

Tetrahymena es un organismo unicelular eucariota ciliado perteneciente al Reino Protozoa y que tiene dos núcleos, un micronúcleo de línea germinal diploide, transcripcionalmente silencioso (MIC) y un macronúcleo somático poliploide, transcripcionalmente activo (MAC). En 1923, cuando el laureado Nobel André Lwoff logró el crecimiento de Tetrahymena en cultivo puro, se estableció la base para explotar este Alveolata como un organismo modelo. Los descubrimientos trascendentes realizados en Tetrahymena son el descubrimiento de los motores de dineína, los telómeros, la catálisis mediada por ARN, la telomerasa y la función de las histona acetiltransferasas en la regulación de la transcripción. En las últimas décadas se han desarrollado técnicas de biología molecular para alterar el genoma y el proteoma de Tetrahymena: los procedimientos de transfección de ADN varían desde la microinyección en el MAC, pasando por la electroporación en el MAC hasta el bombardeo biolístico del MIC y el MAC. Están disponibles plásmidos episomales basados en un replicón de ADNr, así como técnicas knock-out/in basadas en recombinación homóloga. Se ha realizado expresión heteróloga a nivel de proteínas de especies relacionadas y también se han silenciado proteínas endógenas por medio de una novedosa técnica ribosómica antisentido. Se ha demostrado el potencial biotecnológico de Tetrahymena en numerosas publicaciones, demostrando rápido crecimiento, alta biomasa, fermentación en equipos convencionales de bacterias/levaduras, mejoramiento de la producción, existencia de medios baratos y químicamente definidos.

Hasta ahora, se han caracterizado sólo unas pocas secuencias de ADN de promotores activos de Tetrahymena útiles para trabajar en biología molecular. Estos comprenden el más bien débil y además dependiente del ciclo celular promotor de histona1 y beta tubulina2 y también los promotores de metalotioneína inducibles por metales pesados.3,4 Las metalotioneínas; que son reguladas por incremento tras el estrés, son proteínas de unión a metales que desempeñan una función en la desintoxicación de la célula. En Tetrahymena se conocen metalotioneínas, cuyos promotores pueden ser inducidos bastante bien por la presencia de cadmio, cobre, cinc (la inducción decrece en este orden) pero apenas con otros factores de estrés como los peróxidos o el calor. Como los metales pesados son tóxicos, inhiben el crecimiento de las células y dan lugar (en concentraciones más elevadas) a la muerte celular, sería favorable un sistema diferente con un menor impacto en la salud del sistema y un inductor que pueda eliminarse sin que queden trazas. Además, debido al fuerte impacto que tienen los cationes de los metales pesados sobre el medio ambiente, la eliminación del medio contaminado consume mucho tiempo y recursos. Como el esfuerzo financiero en los procesos de bioproducción comercial debe ser mínimo, los promotores de metalotioneínas no parecen ser el sistema inducible de elección

Descripción de la invención

Las proteínas de choque térmico, HSP, son proteínas de respuesta al estrés evolutivamente conservadas con múltiples funciones de protección dentro de la célula. Estas proteínas son ubicuas, se encuentran en todo los organismos eucariotas estudiados hasta la fecha y son inducibles mediante calor, estrés, así como por una diversidad de otros agentes externos. Por consiguiente, las células responden a estos inductores, tales como las temperaturas elevadas de crecimiento, sintetizando altos niveles de HSP y reduciendo de manera coordinada la tasa de síntesis de otras proteínas celulares. Las HSP se dividen en varios grupos en base al tamaño. Su aparición en Tetrahymena ha sido descrita hace más de 20 años, también.5 En Tetrahymena thermophila se han descrito cuatro proteínas pertenecientes a la familia de HSP70 (Nº de acceso AK29100) y HSP90 (Nº de acceso AAD41357) y se han caracterizado en términos de secuencias parciales de aminoácidos,6 pero aún no se han dilucidado las secuencias del promotor activo.

La regulación de las HSP en otros sistemas ha sido estudiada extensamente por varios autores y se ha demostrado que la fuerza del promotor no es la única responsable del nivel de expresión de proteínas: para HSP70 de Drosophila se sabe que también las regiones 3' no traducidas de las transcripciones del gen de hsp70 son responsables de regular el nivel de síntesis de proteína o de ARNm en la célula tanto en estado inducido como no inducido. En la región del promotor se encuentra un elemento de choque térmico HSE en posición 5' al inicio ATG de los genes de choque térmico eucariotas.7 Esta región incluye las secuencias nGAAn y nTTCn, repetidas al menos dos veces en orientación cabeza a cabeza o cola a cola. El número y la orientación de los HSE en los genes HSP difieren entre especies, pero la unión de un factor positivo de transactivación, el factor de choque térmico (HSF) a los elementos de choque térmico es aproximadamente cien veces superior que el de cualquier otro factor de transcripción de mamífero conocido a su sitio de unión respectivo, convirtiendo a estos promotores en los más fuertes conocidos hasta el momento.

Por consiguiente, los promotores de HSP de diversos organismos han sido usados en sistemas de expresión heterólogos para muchas proteínas. 8,9

Como los genomas de los organismos no sólo varían en su utilización de codones sino también en su contenido de AT, es obvio que los promotores de especies menos relacionadas no funcionarán si se intercambian entre estos sistemas. En el reino de los protistas, los genomas son muy ricos en AT y, como se señaló anteriormente, sólo algunos promotores han sido caracterizados. Se ha descubierto que los promotores muy conocidos y ampliamente utilizados de levaduras, E. coli, mamíferos y virus no funcionan en los ciliados (observación no publicada propia).

Sin embargo, la presente divulgación muestra que los promotores de la familia de proteínas de choque térmico de Tetrahymena pueden utilizarse para la expresión controlada de genes externos en niveles elevados. El promotor inducible por calor según la invención tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1, denominado también promotor HSP90, o sus fragmentos eficaces como promotor.

La presente invención también está dirigida a la utilización de los promotores inducibles por calor según la invención para la expresión de proteínas homólogas y/o heterólogas en el ciliado Tetrahymena thermophila.

Puede resultar de preferencia que el promotor inducible por calor según la invención esté integrado en un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la proteína de interés. Este vector contiene de preferencia la secuencia terminadora de β-tubulina 2 de Tetrahymena thermophila adyacente a la posición 3' de la secuencia codificadora de la proteína de interés.

Estos promotores son inducibles sólo por calor y no necesitan la adición de sustancias químicas. La inducción del producto es múltiple. El nivel de fondo de actividad de transcripción es bajo con lo que se demuestra que son promotores ideales tanto para productos tóxicos como letales y por otra parte sirven como herramientas muy útiles para desactivaciones y activaciones condicionales. Durante la fermentación, el proceso de síntesis puede detenerse fácilmente simplemente bajando la temperatura: las células se recuperarán y la biosíntesis podrá volver a inducirse nuevamente. Esto ofrece rendimientos más altos que otros sistemas: como fermentación continua es un procedimiento bien establecido para ciliados y como el estrés térmico puede extraerse del cultivo fácilmente, el ciclo de producción puede repetirse una y otra vez. En el ejemplo que se presenta a continuación los ARNm heterólogos producidos son más estables que los ARNm de HSP endógenos: esto se consigue mediante el uso de un terminador 3' de β-tubulina 2 de T. thermophila. Por esta razón el ARNm del gen diana está todavía presente y se traduce en la fase de recuperación del cultivo. Estas propiedades de la invención dan lugar a un proceso de producción nuevo y eficiente hasta el momento no descrito.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

La Figura 1 muestra el plásmido de expresión utilizado para verificar la biosíntesis... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Promotor inducible por calor de la familia de proteínas de choque térmico del ciliado Tetrahymena thermophila, según el cual el promotor tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1 o sus fragmentos eficaces como promotor.

2. Uso del promotor inducible por calor de la reivindicación 1 para la expresión de proteínas heterólogas en el ciliado Tetrahymena thermophila.

3. Uso según la reivindicación 2, según el cual el promotor inducible por calor está integrado en un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la proteína de interés.

4. Uso según la reivindicación 2 y/o 3, según el cual el vector contiene la secuencia terminadora de β-tubulina 2 de 10 Tetrahymena thermophila adyacente a la posición 3' de la secuencia codificadora de la proteína de interés.


 

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