PROCEDIMIENTO DE CRIBADO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES DE MICROORGANISMOS DEFICIENTES EN LA SECRECIÓN DE PROTEASAS.

Procedimiento para la identificación de cepas de un microorganismo deficientes en la secreción de proteasas,

· en el que se producen mutantes del microorganismo, · en las cavidades de una placa de microvaloración se genera un gel, · en cada una de las cavidades del gel se añade un mutante del microorganismo, · se incuba en condiciones en las que los mutantes del microorganismo secretan proteínas, · los mutantes del microorganismo se separan del gel, conteniendo el gel al menos un substrato para al menos una proteasa de secreción del microorganismo y/o siendo el propio gel el substrato y/o añadiéndose el substrato más tarde y difundiéndose al menos parcialmente en el gel, y se mide la actividad de proteasas sobre el substrato

Es objeto de la invención un procedimiento para la identificación de cepas de microorganismos deficientes en la secreción de proteasas.

En la biotecnología existe una gran necesidad de sistemas de expresión con los que puedan producirse proteínas en 5 grandes cantidades y en la forma en que se presentan fisiológicamente. Una de muchas posibilidades es la expresión heteróloga en microorganismos que producen las proteínas, dado el caso modificarlas post-traduccionalmente y secretarlas entonces. El fundamento para esto es modificar genéticamente el microorganismo para que produzca la proteína extraña. Entre los organismos en los que se lleva a cabo una expresión heteróloga y una secreción subsiguiente se cuentan ciliados como Tetrahymena y levaduras como Pichia pastoris. 10

La utilización de tales sistemas de expresión heteróloga ofrece muchas ventajas. Así, es posible recurrir a T. termophila económicamente y llegar en poco tiempo a elevadas densidades celulares (SALIBA y col., 1983; KIY & TIEDTKE, 1992). Además se han establecido métodos para modificar organismos por ingeniería genética con los que pueden producirse proteínas extrañas en grandes cantidades (TONDRAVI & YAO, 1986, YU y col., 1990; GAERTIG & GOROVSKY, 1992; GAERTIG y col., 1994, CASSIDY-HANLEY y col., 1997). Estas proteínas se glicosilan de forma similar a las proteínas 15 humanas, lo que las hace interesantes para una utilización farmacéutica (TANIGUCHI y col.; 1985). Una de las ventajas esenciales de este sistema de expresión consiste en que las proteínas sintetizadas por T. termophila se secretan al medio, lo que simplifica la purificación de las proteínas (KIY, 1993).

Un problema en el uso de tales sistemas de expresión heteróloga es sin embargo frecuentemente la secreción natural de proteasas. Así, es sabido por ejemplo que la T. termophila secreta de modo natural grandes cantidades de proteasas al 20 medio (BANNO & NOZAWA, 1982, Banno y col., 1982; Banno y col., 1983). Como estas proteasas no se han caracterizado, apenas hay informaciones más detalladas. Las proteínas expresadas heterólogamente son en comparación con las proteínas endógenas claramente más susceptibles a la degradación proteolítica. Por el contrario, la actividad funcional de las enzimas extracelulares de T. termophila no se limita substancialmente por las proteasas secretadas (KIY, 1993b). La consecuencia de la actividad proteolítica es una significativa reducción del rendimiento de la proteína 25 expresada heterológamente.

Para evitar la degradación son posibles distintos planteamientos, como la adición de inhibidores de proteasas o de substratos competitivos como la caseína, o la producción de cepas con menor actividad proteolítica. Actualmente, sin embargo, por ejemplo para Tetrahymena termophila, no hay disponible ninguna cepa deficiente en la secreción de proteasas. Se ha descrito ya un mutante (HÜNSELER y col.; 1987) que generalmente está limitado en su secreción. 30 Un mutante semejante es sin embargo inadecuado para la expresión heteróloga de proteínas, pues ciertamente no secretan proteasas, pero tampoco las proteínas objetivo deseadas.

La determinación de los mutantes deficientes en secreción se realizó conforme a HÜNSELER y col., 1992 con un procedimiento de cribado. A este respecto se punzonaron en una placa de agar agujeros que se aspiraron con una pipeta. En estos agujeros se vertieron los cultivos celulares. El procedimiento es relativamente complicado y no 35 automatizable. Existe también el peligro de contaminaciones cruzadas en caso de dañarse la fina capa de agar. El procedimiento tampoco puede utilizarse o automatizarse a gran escala.

En general existe para sistemas de expresión secretores una alta necesidad de cepas con menor o sin ninguna actividad proteolítica.

Se ha desarrollado ya un procedimiento para el cribado de mutantes hipersecretores de T. termophila (HARTMANN, 40 2000). En este método los mutantes se ponen en placas de microvaloración de 96 pocilllos. Las células se separan entonces por ultracentrifugación en una zona de distinta densidad. A este respecto a cada uno de los cultivos se le pone una capa inferior de polímero (Ficoll) y las células se centrifugan en el Ficoll. El sobrenadante se retiró con una pipeta. Por ensayo enzimático se determinaron mutantes que presentaban elevada actividad en proteínas secretadas como β-hexaminidasa y fosfatasa ácida. 45

Este procedimiento exige un elevado coste en tiempo. Además no puede excluirse que se llegue a una lisis celular en la que no se liberen proteínas secretadas que modifiquen el resultado.

La invención se plantea el objetivo de proporcionar un procedimiento para el cribado conforme a sistemas de secreción mejorados para la expresión heteróloga de proteínas. En especial el procedimiento debe hacer posible el hallazgo de mutantes de microorganismos que presenten un rendimiento mejorado en proteínas expresadas 50 heterólogamente secretadas.

El procedimiento debe hacer posible analizar en poco tiempo y a costes moderados una multiplicidad de mutantes.

El objetivo que se plantea la invención se ha conseguido sorprendentemente mediante un procedimiento y microorganismos conforme a una de las reivindicaciones 1 a 15.

En general el procedimiento puede llevarse a cabo con mutantes de microorganismos que secretan proteasas y que son adecuados para la secreción de proteínas objetivo expresadas heterólogamente. Con el término de proteasas de 5 secreción se quiere decir aquellas proteasas que secreta el tipo natural del microorganismo a su entorno. El procedimiento conforme a la invención hace posible la medición de la actividad de proteasas in vivo.

El microorganismo se selecciona preferiblemente del grupo compuesto por ciliados y levaduras. Tales microorganismos expresan proteínas propias con actividad enzimática como proteasas. Son levaduras especialmente adecuadas Pichia pastoris. El procedimiento es adecuado también para el cribado de algas 10 monocelulares, en especial de Chlamydomonas, Ulva y Euglena, y procariotas, en especial Bacillus y Escherichia. Son ciliados especialmente adecuados aquellos del género Tetrahymena, en especial Tetrahymena thermophila, malaccensis, ellioti, alphaeliotti, pyriformes, setosa, alphapyriformis, betapyriformis, leucophyris, silvani, vorax, tropicalis, deltatropicalis, borealis, canadensis, rostrata, alphacanadensis, betacanadensis, mimbres, americanis americanis, paraamericanis, australis, hegewishi, hyperangularis, nanneyi, nippisingi, pigmentosa, pigmentosa oriasi, 15 pigmentosa europigmentosa, sonneborni, asiatica, capricornis, patula, allensae, cosmopolitanis o shanghaiensis.

Los mutantes de los microorganismos pueden producirse por métodos conocidos, como mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida. El procedimiento es especialmente ventajoso con microorganismos con los que no se obtienen o solo difícilmente cepas deficientes en secreción de proteasas por motivos técnicos o debido a la falta de información genética. Son especialmente preferidos procedimientos genéticos de cruce. 20

Un procedimiento especialmente preferido para la producción de mutantes es la citogamia uniparental (UPC). Se trata de un procedimiento genético de cruce. Este se lleva a cabo preferiblemente como se describe por Cole y Bruns (1992). Con ello se hace referencia expresa al procedimiento ahí descrito. Este procedimiento permite expresar hasta 20 veces más mutaciones que, por ejemplo, el procedimiento de exclusión del genoma por cortocircuito utilizado por Hünseler y col. (1987). De este modo el rendimiento de mutantes es mayor en un factor de 20. 25

La incubación del mutante del microorganismo se realiza con el gel preferiblemente en un medio acuoso adecuado, preferiblemente un medio nutritivo. En cualquier caso deben reinar condiciones (valor del pH, concentración de iones, etc.) que se parezcan a las condiciones fisiológicas, de modo que se impida la muerte y la lisis de los microorganismos.

La incubación de los microorganismos con el gel se realiza en formas de realización preferidas durante 2 h a 2 30 semanas, en especial durante 1 a 5 días.

Son medios nutritivos adecuados o contienen leche en polvo desnatada, proteosa-peptona, extracto de levadura, peptona de habas de soja, solución de sulfato/quelato ferroso (100X, fa. Sigma) y/o glucosa monohidratada. También puede utilizarse un medio químico definido (CDM) conforme a una formulación precisa de los distintos ingredientes.

1. Procedimiento para la identificación de cepas de un microorganismo deficientes en la secreción de proteasas,

· en el que se producen mutantes del microorganismo,

· en las cavidades de una placa de microvaloración se genera un gel,

· en cada una de las cavidades del gel se añade un mutante del microorganismo, 5

· se incuba en condiciones en las que los mutantes del microorganismo secretan proteínas,

· los mutantes del microorganismo se separan del gel,

conteniendo el gel al menos un substrato para al menos una proteasa de secreción del microorganismo y/o siendo el propio gel el substrato y/o añadiéndose el substrato más tarde y difundiéndose al menos parcialmente en el gel, 10

y se mide la actividad de proteasas sobre el substrato.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona del grupo constituido por ciliados, en especial Tetrahymena, levaduras, en especial Pichia pastoris, algas unicelulares, en especial Chlamydomonas, Ulva y Euglena, y procariotas, en especial Bacillus y Escherichia.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó 2, en el que los mutantes del microorganismo se producen por 15 mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida.

4. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó 2, en el que los mutantes del microorganismo se producen por citogamia uniparental (UPC).

5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la incubación de los mutantes del microorganismo se realiza con el gel en un medio nutritivo. 20

6. Procedimiento conforme a la reivindicación 5, en el que el medio nutritivo contiene leche en polvo desnatada, proteosa-peptona, extracto de levadura, peptona de habas de soja, solución de sulfato/quelato ferroso y/o glucosa monohidratada, o es un medio sintético.

7. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gel es un gel de gelatina, de agarosa, de agar y/o de poliacrilamida. 25

8. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el substrato para la proteasa se selecciona del grupo constituido por caseína, derivados de caseína, caseína marcada fluorescentemente y/o gelatina.

9. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la incubación se realiza en condiciones en las que el microorganismo secreta proteasas y las proteasas secretadas pueden difundirse en el gel.

10. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el microorganismo se separa del gel por 30 decantación, con pipeta, por aspiración y/o por lavado.

11. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la proteolisis del substrato produce una señal de fluorescencia o señal de absorción, cuya intensidad se mide y con el resultado se determina la actividad de proteasas.

12. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el procedimiento se lleva a cabo de modo 35 automatizado.