Deficiencia de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en Tetrahymena y su uso.

Un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida oesencialmente sin actividad de o con actividad de de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividadde o con ambas actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS) reducidas o esencialmentesin actividad,

que comprende las etapas de:

a) transformación de células ciliadas insertando una construcción que contiene un alelo que altera el gen quecodifica la DHFR-TS endógena en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del macronúcleo del ciliado(MAC).

b) inducción de un proceso de mezclado alélico en las células ciliadas transformadas para generar células quetienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC, e

c) identificación de las células generadas en la etapa b) por cultivo comparativo con o sin timidina,y el gen DHFR-TS tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con Sec. ID Nº 1.

Deficiencia de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en Tetrahymena y su uso

Campo de la invención La presente invención se dirige a los campos de biología molecular recombinante, en particular al uso de una enzima marcadora bifuncional en Tetrahymena que permite la selección de transformandos y facilita el descubrimiento de fármacos en la investigación de parásitos protozoarios.

Antecedentes de la invención Tetrahymena es un organismo unicelular eucariota que pertenece al reino Protozoa y que tiene dos núcleos, uno transcripcionalmente silente, el micronúcleo de línea germinal diploide (MIC) y uno transcripcionalmente activo, el

macronúcleo somático poliploide (MAC) . En 1923, cuando el Premio Nobel Andre Lwoff tuvo éxito en el cultivo de Tetrahymena en cultivo puro, puso las bases de la explotación de este alveolado como modelo. Los descubrimientos en Tetrahymena hechos por Milestone son el descubrimiento de los motores de dineína, los telómeros, la catálisis mediada por ARN, la telomerasa y la función de las histona acetiltransferasas en la regulación de la transcripción. En las últimas décadas, las técnicas de biología molecular se han desarrollado como para alterar el genoma y el proteoma de Tetrahymena: los procedimientos de transfección de ADN comprenden entre otros la microinyección en el MAC por electroporación y bombardeo biolístico del MIC y MAC. Están disponibles plásmidos episomales basados en un replicón de ADNr, así como las técnicas knock-out/in basadas en recombinación homóloga. A nivel proteico, se ha llevado a cabo la expresión heteróloga de especies relacionadas y también se han silenciado las proteínas endógenas por una nueva técnica de antisentido ribosómico. Las ventajas de la utilización de Tetrahymena en las aplicaciones biotecnológicas incluyen el crecimiento rápido, la alta biomasa, la fermentación en instalaciones ordinarias para bacterias/levaduras, la producción a gran escala, así como la existencia de medios baratos y definidos químicamente.

Hasta ahora, solamente se han descrito unos pocos marcadores que se puedan utilizar en Tetrahymena: las resistencias mediadas por mutación de punto ribosómica, una resistencia a la neomicina basada en un plásmido y un marcador complicado de selección de beta-tubulina que utiliza un promotor inducible en combinación con tubulinas mutadas que son resistentes/ sensibles al fármaco mitótico taxol1. Aún no está disponible ningún marcador auxotrófico verdadero que permita la selección sin el uso de antibióticos o fármacos. Esto es lo que solicita la presente invención.

Schlichterle, I Martha y col., desvelan en Molecular and general genetics vol. 250, Nº 6, 1996, páginas 665-673 un análisis de clonación y molecular del gen de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en el protozoario ciliado Paramecium tetraurelia.

Descripción de la invención Las enzimas críticas en la biosíntesis de pirimidina son las enzimas dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidilato sintasa (TS) . La DHFR cataliza la producción de tetrahidrofolato a partir del dihidrofolato; la TS se encarga de la transferencia de un grupo metilo de N5. N10-metilén- tetrahidrofolato a dUMP generando de esta manera dTMP y

tetrahidrofolato. Estas enzimas son cruciales para la síntesis de pirimidina y se han utilizado como marcadores auxotróficos en varios sistemas por destrucción génica dirigida, pero también se han desarrollado varios inhibidores (antifolatos) como fármacos antiparasitarios. En los animales, hongos y eubacterias el gen de la DHFR y TS se traducen por separado, mientras que en plantas, Alveolata y Euglenozoa tienen una fusión génica bifuncional que combina en una proteína las actividades de ambas enzimas (“DHFR-TS”) .

La existencia de la enzima bifuncional en Tetrahymena pyriformis se postuló en 19842 y 19853 pero no se ha llevado a cabo ningún análisis funcional ni molecular biológico. En 20014 se publicó una secuencia de aminoácidos parcial de DHFR-TS, de una “cepa similar a T. pyriformis” sin determinar, pero a este trabajo le falta cualquier prueba de la relación del ADNc parcial descrito con la función de la enzima.

La presente invención proporciona una caracterización detallada del gen DHFR-TS de T. thermophila incluyendo la estructura génica y los datos funcionales de la enzima incluyendo datos de la función in vivo. Además de un marcador auxotrófico simple que se describe por primera vez en ciliados, la combinación de estos resultados con ciertas propiedades fuera de lo común de Tetrahymena dan como resultado una herramienta poderosa para el desarrollo y descubrimiento de nuevos antifolatos contra los parásitos apicomplejos como por ejemplo Plasmodium sp. (malaria) , Toxoplasma gondii (toxoplasmosis) y Cr y ptosporidium sp. (criptosporidiosis) .

Se han hecho grandes esfuerzos para luchar contra estos graves problemas en todo el mundo, dirigiéndose contra la DHFR-TS de los parásitos mencionados anteriormente con antifolatos. El éxito inicial en la lucha contra la malaria 65 fue superado por la aparición de cepas de Plasmodium resistentes a los fármacos. Especialmente en el caso de la malaria, la diversidad de DHFR-TS es múltiple debido a la existencia de cepas diferentes (P. falciparum, P. vivax, P.

malariae, P. ovale) y a la alta frecuencia de recombinación de ADN / mutaciones que producen nuevas resistencias una y otra vez. Revelando la estructura cristalina de las enzimas mutantes y por tanto DHFR-TS resistentes, se han desarrollado nuevos fármacos de molécula pequeña por modelado molecular asistido por ordenador. El problema principal es el ensayo de la eficacia de los fármacos candidatos: ya que los endoparásitos son difíciles de cultivar y 5 tienen un ciclo vital anormalmente complejo que hace casi imposible el ensayo directo de los nuevos compuestos. Se puede dar un rodeo, utilizando el gen deficiente dhr1 de cepas S5 de levaduras, que expresen la enzima funcional DHFR-TS parasitaria de interés y de esta manera reconstituir la deficiencia de dhr1. Sin embargo esta estrategia tiene muchas desventajas: el codón de utilización en parásitos apicomplejos, es muy diferente de todos los que se utilizan comúnmente en los sistemas de expresión como E. coli, levaduras y líneas celulares de mamíferos y algunos de los ARNt que se necesitan para la traducción no son abundantes en estos modelos de organismos. Apicomplexa/ Sporozoa, pertenecen al grupo filogenético Alveolata, que posee varias características celulares biológicas especiales, la más notable es la presencia de alveolos corticales, vesículas aplanadas envueltas en una capa continua que sirve de soporte a la membrana. Ningún modelo de organismo descrito hasta ahora tiene esa variedad de propiedades especiales que tendrá una influencia en la absorción y virtudes de los fármacos.

Todos estos problemas mencionados anteriormente se pueden superar con el uso de Tetrahymena:

Pertenece a los Alveolata y es la especie más estrechamente relacionada con los apicomplejos. La Tetrahymena es capaz de crecer en medios químicos definidos sin la presencia de timidina compitiendo por una ruta funcional 20 silvestre para la síntesis de dTMP por medio de una enzima DHFR-TS bifuncional. La deficiencia en la actividad de de esta enzima debería dar líneas celulares que solo crecieran en medios suplementados con timidina. Para destruir la actividad de DHFR-TS se pueden utilizar varias técnicas comunes como por ejemplo, knockout del gen elegido, mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos esenciales y mutagénesis aleatoria. La selección de clones deficientes de DHFR-TS se puede llevar a cabo por replicación del cultivo en placas en medios con (T+) o sin 25 timidina (T-) . Los clones potenciales deberían crecer solamente en T+ pero no en T-. La reconstitución satisfactoria de la actividad de la enzima se puede conseguir transformando las células mencionadas anteriormente con fragmentos de ADN que codifiquen una enzima DHFR-TS funcional que produzcan las células que crezcan en T-. Este procedimiento permite la selección de transformandos sin utilizar fármacos o antibióticos. Para el caso de los exógenos, DHFR-TS recombinante que se deriva de los parásitos apicomplejos,

se consigue un sistema modelo ideal para la selección de fármacos antifolato que se puede utilizar fácilmente en un sistema de alto rendimiento.

Se reivindica un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida o esencialmente sin actividad o actividad de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividad o 35 actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS)... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida o esencialmente sin actividad de o con actividad de de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividad

de o con ambas actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS) reducidas o esencialmente sin actividad, que comprende las etapas de:

a) transformación de células ciliadas insertando una construcción que contiene un alelo que altera el gen que codifica la DHFR-TS endógena en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del macronúcleo del ciliado (MAC) . b) inducción de un proceso de mezclado alélico en las células ciliadas transformadas para generar células que tienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC, e c) identificación de las células generadas en la etapa b) por cultivo comparativo con o sin timidina,

y el gen DHFR-TS tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con Sec. ID Nº 1.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa a) la construcción que contiene un alelo que altera el gen que codifica la DHFR-TS endógena se inserta en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del micronúcleo del ciliado (MIC) , y en la etapa b) las células que tienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC se generan por cruce de las células de la etapa a) con otras células ciliadas para producir una descendencia que contiene un nuevo MAC derivado del MIC alterado.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 y/o 2, en el que el ciliado es Tetrahymena, en particular

Tetrahymena thermophila. 25

4. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1-3, en el que además se ha alterado la región de 1, 5 kb secuencia arriba y abajo del gen endógeno de la célula que codifica la enzima bifuncional DHFR-TS.

5. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1-4 que comprende una etapa adicional de reconstitución de la actividad de la DHFR-TS por transfección de las células con una molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS endógena funcional así como otra proteína o enzima DHFR-TS no endógena funcional.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un alveolado.

7. El procedimiento de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 5 y/o 6, en el que la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un ciliado. 40

8. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicacione.

5. 7, en el que la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS se deriva de Tetrahymena.

9. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicacione.

5. 6, en el que la molécula de ADN o ARN 45 que codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un apicomplejo.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional es la Sec. ID Nº 1.

11. Una célula ciliada con una auxotrofía por la timidina, obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.

12. La célula ciliada de acuerdo con la reivindicación 11 con actividad de DHFR reducida o esencialmente sin actividad o actividad de TS reducida o esencialmente sin actividad o ambas actividades de DHFR-TS reducidas o 55 esencialmente sin actividad, en particular obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Una célula ciliada con actividad de DHFR-TS reconstituida, obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5.

14. El uso de células ciliadas de acuerdo con la reivindicación 13 en un ensayo para detectar compuestos químicos que afectan a la actividad de la enzima DHFR-TS, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto las células con el compuesto a ensayar, b) medir la actividad de la enzima DHFR-TS de las células, y 65 c) comparar la actividad de la enzima DHFR-TS con la actividad de la enzima DHFR-TS de las células de control.

15. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína DHFR-TS que tiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Sec. ID Nº 1.

Figura 2: pKOI: Construcción de inactivación de GHFR-TS

El transformante contiene Pérdida de actividad de al menos un alelo DHFR-DHFR-TS por el reemplazo TS inactivado completo del gen DHFR-TS recombinante funcional con el alelo inactivado Figura 4: Selección de células DHFR-TS inactivadas por crecimiento en timidina

Figura 7: Función enzimática de desactivación en la diana

Figura 8: Expresión de la diana activada Figura 9: Resumen de la reconstitución de la actividad de DHFR-TS mediante activación