Un procedimiento para producir un polipéptido de IL-29 que comprende:

(a) cultivar una célula hospedadora de E. coli ompT deficiente y/o fhuA deficiente que comprende un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: (i) un promotor de la transcripción; (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-29 que comprende los restos de aminoácidos 1-182 de la SEQ ID NO: 2, los restos de aminoácidos 1-183 de la SEQ ID NO: 4, o los restos de aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6; y (iii) un terminador de la transcripción en un primer medio de crecimiento en condiciones en las que el polipéptido de IL-29 codificado se expresa en un matraz con agitación a una DO600 de 5 a 20; (b) inocular un reactor de fermentación con de 1 a 5% v/v de medio del matraz de agitación que contiene las células hospedadoras; (c) cultivar las células hospedadoras en un segundo medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, en el que una disolución de carbohidratos se alimenta al reactor de fermentación a las 6 a 8 horas de tiempo de fermentación transcurrido; (d) añadir un agente de inducción al reactor de fermentación a las 20 a 30 horas de tiempo de fermentación transcurrido; y (e) cosechar las células hospedadoras a de 48 a 56 horas de tiempo de fermentación transcurrido

La creciente disponibilidad e identificación de genes procedentes de genomas humanos y otros ha conducido a una creciente necesidad de una expresión y purificación eficaces de proteínas recombinantes. La expresión de proteínas en bacterias es de manera remarcable el enfoque más ampliamente usado para la producción de genes clonados. Por muchas razones, se prefiere la expresión en bacterias a la expresión en células 5 eucariotas. Por ejemplo, es mucho más fácil hacer crecer bacterias que células eucariotas. Más específicamente, la disponibilidad de una abundancia de sofisticadas herramientas genéticas moleculares y de miles de mutantes hacen de E. coli, como hospedador de expresión, extremadamente útil para la producción de proteínas. Sin embargo, ha sido a menudo difícil obtener un elevado nivel de producción de proteínas funcionales en E. coli, especialmente de aquellas procedentes de fuentes eucariotas. 10

IL-28A, IL-28B, e IL-29 comprenden una nueva familia de proteínas recientemente descubierta que tienen homología de secuencias con interferones de tipo I y homología genómica con IL-10. Esta nueva familia se describe completamente en la solicitud PCT de titularidad compartida WO 02/086087 y en Sheppard y col., Nature Immunol. 4: 63-68, 2003. Funcionalmente, IL-28A, IL-28B e IL-29 asemejan INF de tipo I en su capacidad de inducir un estado antivírico en células, pero, a diferencia de los IFN de tipo I, no muestran actividad antiproliferativa frente a 15 algunas líneas de linfocitos B.

Se ha producido IL-29 recombinante en células procariotas, en particular en E. coli. La proteína bacteriana resultante producida no está glicosilada, y se produce en un estado agregado La producción de IL-29 a partir de E. coli requiere que las proteínas agregadas se solubilicen a partir de cuerpos de inclusión insolubles y renaturalizados o replegados. Sin la renaturalización, la actividad específica de la proteína recombinante se verá 20 significativamente reducida.

A pesar de los avances en la expresión de proteínas recombinantes en hospedadores bacterianos, existe una necesidad de procedimientos mejorados para producir proteínas IL-29 recombinantes biológicamente activas y purificadas en sistemas procariotas que den como resultado mayores rendimientos de producción de proteínas. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras referencia a la siguiente descripción detallada. 25

El documento WO 2005/023862 describe preparaciones homogéneas de IL-29.

El documento CN 1670033 describe un procedimiento para preparar IL-29 humana, y una cepa genomanipulada de IL-29 recombinante.

Sheppard P. y col., Nature Immunology, Vol. 4(1), enero de 2003, páginas 63-68, describen IL-28, IL-29 y su receptor de citocinas de clase II IL28R. 30

En la memoria descriptiva que sigue, se usan ampliamente numerosos términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención.

A no ser que se especifique de otra forma, “un”, “uno”, “el” y “al menos uno” se usan indistintamente y significan uno o más de uno.

Según se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a 35 polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante

cualquier ligadura, escisión, acción de endonucleasa, y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros, que son nucleótidos que se producen naturalmente (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen naturalmente (por ejemplo, formas α-enantioméricas de nucleótidos que se producen naturalmente), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcares y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de 5 azúcares incluyen, por ejemplo, sustitución de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas, y grupos azida, o se pueden funcionalizar azúcares como éteres o ésteres. Además, se puede sustituir el resto azúcar completo con estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Entre los ejemplos de modificaciones en el resto base se incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Se pueden unir monómeros de ácido 10 nucleico mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces Entre los análogos de enlaces fosfodiéster se incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato, y similares. El término “molécula de ácido nucleico” incluye también los denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que comprenden bases de ácidos nucleicos que se producen naturalmente o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser tanto monocatenarios como bicatenarios. 15

La expresión “complemento de una secuencia de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria y orientación inversa en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia.

Un “potenciador” es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, con respecto a la distancia o a la orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción. 20

“ADN heterólogo” se refiere a una molécula de ADN, o a una población de moléculas de ADN que no existe naturalmente en una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogo de una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de las especies de células hospedadoras (es decir, ADN endógeno) siempre que el ADN del hospedador esté combinado con ADN no hospedador (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no hospedador que codifica un polipéptido unido 25 de manera operable con un segmento de ADN hospedador que comprende un promotor de la transcripción se considera que es ADN heterólogo si la molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen natural.

El término “contig” denota una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria con otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas se “solapan” 30 en un tramo dado de una molécula de ácido nucleico bien en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico.

“ADN complementario (ADNc)” es una molécula de ADN monocatenario que está formado a partir de una plantilla de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Normalmente, se emplea un cebador complementario con las porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica 35 usan el término “ADNc” para referirse a una molécula de ADN bicatenario constituida por dicha molécula de ADN monocatenario y su cadena de ADN complementario. El término “ADNc” se refiere también a un clon de una

molécula de ADNc sintetizada a partir de una plantilla de ARN.

Una “molécula de ácido nucleico aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico es una molécula de ADN aislado. Otro ejemplo de una molécula de ADN aislado es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizado que no está integrada en el genoma de 5 un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeñas que la molécula de ADN completo de un cromosoma de esta especie.

“ADN lineal” denota moléculas de ADN no circular con extremos 5' y 3' libres. Se puede preparar ADN lineal a partir de moléculas cerradas de ADN circular, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o perturbación física. 10

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1. Un procedimiento para producir un polipéptido de IL-29 que comprende:

(a) cultivar una célula hospedadora de E. coli ompT deficiente y/o fhuA deficiente que comprende un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: 5

(i) un promotor de la transcripción;

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-29 que comprende los restos de aminoácidos 1-182 de la SEQ ID NO: 2, los restos de aminoácidos 1-183 de la SEQ ID NO: 4, o los restos de aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6; y

(iii) un terminador de la transcripción 10

en un primer medio de crecimiento en condiciones en las que el polipéptido de IL-29 codificado se expresa en un matraz con agitación a una DO600 de 5 a 20;

(b) inocular un reactor de fermentación con de 1 a 5% v/v de medio del matraz de agitación que contiene las células hospedadoras;

(c) cultivar las células hospedadoras en un segundo medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 15 7,2, en el que una disolución de carbohidratos se alimenta al reactor de fermentación a las 6 a 8 horas de tiempo de fermentación transcurrido;

(d) añadir un agente de inducción al reactor de fermentación a las 20 a 30 horas de tiempo de fermentación transcurrido; y

(e) cosechar las células hospedadoras a de 48 a 56 horas de tiempo de fermentación transcurrido. 20

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la disolución de alimentación de carbohidratos comprende un glicerol o glucosa a una concentración a una concentración de 10 a 30 g/l de medio de crecimiento, y a una velocidad de alimentación de 5-15 gramos de glicerol o glucosa por litro por hora.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el vector de expresión comprende además un potenciador de la traducción. 25

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el potenciador de la traducción es la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el agente de inducción de la etapa (d) es isopropil tiogalactopiranósido, preferiblemente en el que se añade isopropil tiogalactopiranósido al cultivo a una concentración de 0,5 mM a 2 mM. 30

6. Un procedimiento de recuperación de un polipéptido de IL-29 procedente de una célula de E. coli ompT deficiente y/o fhuA deficiente que comprende:

(a) cultivar la célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos de manera operable:

(i) un promotor de la transcripción; 35

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-29 que comprende

los restos de aminoácidos 1-182 de la SEQ ID NO: 2, los restos de aminoácidos 1-183 de la SEQ ID NO: 4, o los restos de aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6; y

(iii) un terminador de la transcripción;

en un medio de crecimiento en condiciones en las que se expresa el polipéptido de IL-29 codificado;

(b) añadir un agente de inducción para inducir la expresión del polipéptido de IL-29; 5

(c) cosechar las células hospedadoras;

(d) lisar las células hospedadoras;

(e) centrifugar las células hospedadoras lisadas;

(f) recuperar el aglomerado de los cuerpos de inclusión;

(g) solubilizar el aglomerado de los cuerpos de inclusión en clorhidrato de guanidina 4-6 M y ditiotreitol 10 10-50 mM durante 1-2 horas a 15-25ºC, y

(h) añadir el polipéptido de IL-29 solubilizado a un tampón de repliegue que comprende 0,05-0,5% de polietilenglicol, sal, arginina 0,5 M – 1,25 M y una mezcla de moléculas reducidas y oxidadas durante 1-26 horas a una temperatura de 4-30ºC y un pH de 7,3-8,5, en el que el polipéptido de IL-29 solubilizado se repliega; 15

(i) detener rápidamente la reacción de repliegue ajustando el pH a 5,5-6,5;

(j) diluir la disolución replegada detenida rápidamente 1,5 a 10 veces en agua o tampón de baja fuerza iónica a pH 5-7; y

(k) filtrar la disolución de repliegue diluida detenida rápidamente mediante filtros para eliminar el precipitado o las partículas. 20

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que las células hospedadoras procariotas de la etapa (d) se lisan mediante homogeneización.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que las células hospedadoras procariotas lisadas de la etapa (e) se centrifugan mediante centrifugación tanto discontinua como continua.

9. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que el polipéptido de IL-29 de la etapa (h) se añade al 25 tampón de repliegue a una concentración final de 0,05-3,0 mg/ml.

10. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que la mezcla de moléculas reducidas y oxidadas del tampón de repliegue se selecciona entre el grupo constituido por cisteína y cistina, ditiotreitol y cistina, glutatión reducido y glutatión oxidado, y ditiotreitol y glutatión oxidado.

11. Un procedimiento de purificación de un polipéptido de IL-29 que comprende: 30

(a) proporcionar el polipéptido de IL-29 según la etapa (k) de la reivindicación 6;

(b) cargar la disolución filtrada que comprende el polipéptido de IL-29 replegado de la etapa (a) en una columna de cromatografía de intercambio catiónico equilibrada con acetato de sodio a pH 5,5;

(c) eluir el polipéptido de IL-29 unido con cloruro de sodio en acetato de sodio, pH 5,5; y

(d) ajustar el eluato con sulfato de amonio a una concentración 1M, y pasar el eluato del polipéptido de 35 IL-29 ajustado a través de un filtro de 0,45 µm.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que el polipéptido de IL-29 se eluye de la columna de

intercambio catiónico para formar un combinado en cloruro de sodio aproximadamente 0,7 M – 0,8 M tras usar la elución en gradiente lineal de cloruro de sodio 0-2 M.

13. El procedimiento de la reivindicación 11 que comprende además:

(e) cargar el polipéptido de IL-29 de la etapa (d) en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba equilibrada con acetato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 5,5; 5

(f) eluir el polipéptido de IL-29 con un gradiente lineal de acetato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M a acetato de sodio 50 mM sin sulfato de amonio, pH 5,5;

(g) diluir el eluato aproximadamente 6 veces con agua o tampón de baja fuerza iónica y pasar el eluato del polipéptido de IL-29 diluido a través de un filtro de 0,2 µm o 0,45 µm.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que el polipéptido de IL-29 se eluye de la columna de 10 cromatografía de interacción hidrófoba en sulfato de amonio aproximadamente 0,75 M a sulfato de amonio 0 M.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 que comprende además:

(h) cargar el polipéptido de IL-29 de la etapa (g) en una columna de cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento equilibrada con acetato de sodio 50 mM que comprende cloruro de sodio 0-300 mM, pH 5,5; y 15

(i) eluir el polipéptido de IL-29 con una concentración mayor de cloruro de sodio en acetato de sodio 50 mM, pH 5,5, en una etapa o formato de elución en gradiente.

16. El procedimiento de la reivindicación 15 en el que el polipéptido de IL-29 se eluye de la columna de cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento en cloruro de sodio aproximadamente 0,4 M a cloruro de sodio 0,6 M tras usar una elución en gradiente de cloruro de sodio de 300 a 800 mM. 20

17. Un procedimiento de concentración de un polipéptido de IL-29 que comprende:

(a) proporcionar el polipéptido de IL-29 según la etapa (i) de la reivindicación 15;

(b) añadir el polipéptido de IL-29 a una placa de filtración en flujo tangencial y un sistema de soporte que comprende una o más membranas con un corte de pesos moleculares de 3-10 kDa;

(c) aplicar una presión transmembrana de 15-25 psi (103,4-172,4 kPa) al sistema para ultrafiltrar la 25 disolución a una concentración mayor; y

(d) filtrar el polipéptido de IL-29 concentrado a través de una membrana de 0,2 µm.

18. Un procedimiento de monopegilación de un polipéptido de IL-29 que comprende:

(a) proporcionar 3-5 g/l del polipéptido de IL-29 producido mediante cualquier reivindicación anterior en una disolución de tampón de acetato de sodio; 30

(b) añadir cianoborohidruro de sodio 10-20 mM a la disolución de la etapa (a);

(c) añadir un exceso molar de 2 veces de polietilenglicol derivatizado a la disolución de la etapa (b); y

(d) mezclar la disolución de la etapa (c) durante 10-18 horas a 16-20ºC.

19. Un procedimiento de purificación de un polipéptido de IL-29 monopegilado que comprende:

(e) proporcionar el polipéptido de IL-29 monopegilado según la etapa (d) de la reivindicación 18; 35

(f) diluir la disolución de la etapa (e) 2 veces con acetato de sodio 50 mM, pH 5,5;

(g) filtrar la disolución de la etapa (f) a través de una membrana de 0,2 µm.

(h) cargar la disolución de la etapa (g) en una columna de cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento equilibrada con acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 5,5;

(i) eluir el polipéptido de IL-29 monopegilado de la columna de cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento con un gradiente lineal de acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,5; 5

(j) añadir el polipéptido de IL-29 monopegilado a una placa de filtración en flujo tangencial y un sistema de soporte que comprende una o más membranas con un corte de pesos moleculares de 3-10 kDa;

(k) aplicar una presión transmembrana de 15-25 psi (103,4-172,4 kPa) al sistema para ultrafiltrar la disolución a una concentración mayor; 10

(l) usar el sistema para intercambiar el tampón del polipéptido de IL-29 concentrado en un tampón de formulación apropiado mediante diafiltración; y

(m) filtrar el polipéptido de IL-29 monopegilado concentrado a través de una membrana de 0,2 µm.

20. El procedimiento de la reivindicación 19 en el que el polietilenglicol comprende mono-metoxiPEG-propionaldehído de 20 kDa o 30 kDa. 15

21. El procedimiento de la reivindicación 19 en el que el polietilenglicol está unido en el extremo N con el polipéptido de IL-29.

22. El procedimiento de la reivindicación 15 o la reivindicación 17 en el que el polipéptido de IL-29 tiene al menos un 98% de pureza según análisis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y los agregados son menos de un 0,2% según HPLC de exclusión por tamaño. 20

23. El procedimiento de la reivindicación 17 en el que el polipéptido de IL-29 tiene un nivel de endotoxina de menos de 10 unidades de endotoxina por miligramo de polipéptido de IL-29 en un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus basado en USP <85>.

24. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que el polipéptido de IL-29 monopegilado está al menos un 99% monopegilado según se midió mediante HPLC en fase inversa. 25

25. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el vector de expresión comprende además un potenciador de la traducción.

26. El procedimiento de la reivindicación 25 en el que el potenciador de la traducción es la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.

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