PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA DE CAPSIDE DEL PAPILOMAVIRUS HUMANO Y PARTÍCULAS DE TIPO VIRUS.
Una partícula o capsómero tipo virus del papiloma virus humano recombinante purificada que comprende una proteína cápsida del papiloma virus L1 humano tipo genital expresada a partir de una secuencia codificadora de proteína L1,
la cual produce una proteína o complejo de proteínas que posee características inmunológicas y morfológicas similares a aquéllas de los papilomavirus naturales, en la que dicha partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros humanos de personas que se conoce están infectadas con virus homólogos
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05075369.
Solicitante: THE UNIVERSITY OF ROCHESTER.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 518 HYLAN BUILDING ROCHESTER, NY 14627-0140 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: ROSE, ROBERT C., REICHMAN, RICHARD C., Bonnez,William.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 8 de Marzo de 1994.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/12 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Antígenos virales.
- C07K14/025 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Papovaviridae, p. ej. virus de papiloma, virus del polioma, SV40, virus BK, virus JC.
Clasificación PCT:
- A61K35/12 A61K […] › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00).
- A61K35/64 A61K 35/00 […] › Insectos, p. ej. abejas, avispas o pulgas.
- A61K39/12 A61K 39/00 […] › Antígenos virales.
- A61K39/395 A61K 39/00 […] › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
- A61P31/12 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › Antivirales.
- A61P35/00 A61P […] › Agentes antineoplásicos.
- C07K14/025 C07K 14/00 […] › Papovaviridae, p. ej. virus de papiloma, virus del polioma, SV40, virus BK, virus JC.
- C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N15/37 C12N 15/00 […] › Papovaviridae, p. ej. virus del papiloma, virus del polioma, SV 40.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12N7/04 C12N […] › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Inactivación o atenuación; Producción de partes elementales de virus.
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda.
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Fragmento de la descripción:
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere de forma general al papilomavirus (PV). La descripción describe un método de expresar la secuencia codificante de proteína de cápside de papilomavirus humano de tipo 6 (HPV-6) y de tipo 11 (HPV-5 11) usando el sistema de expresión en baculovirus, producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV y el uso de estas VLP en la producción de anticuerpos que reconocen epítopos en HPV y para el desarrollo de la vacuna de HPV y para el desarrollo de ensayos serológicos para la detección de la infección por HPV, pero los mismos no forman parte de la invención como tal.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10
La familia Papovaviridae constituye un grupo de virus de ADN que inducen tanto infecciones líticas como tumores benignos o malignos. Estructuralmente, todos son viriones icosaédricos desnudos con 72 capsómeros y contienen ADN circular bicatenario. Los virus incluidos en la familia son: (1) papilomavirus humanos y animales, (2) poliomavirus de ratón, (3) virus vacuolantes de simio y (4) virus BK y JC humanos.
Los papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelios cutáneo, genital, oral y respiratorio de un modo específico 15 de tejido. La infección por HPV se ha asociado estrechamente con el desarrollo tanto de lesiones benignas como de neoplasias malignas (Reichman et al., Papillomaviruses, 1990, págs. 1191-1200; y Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3ª Edición, Churchill Livingstone, New York, N.Y.). Por ejemplo, el HPV de tipo 1 (HPV-1) está presente en verrugas plantares, los HPV de tipo 6 u 11 (HPV-6 o HPV-11) en condylomata acuminata (verrugas anogenitales), mientras que el HPV de tips 16 ó 18 (HPV-16 ó HPV-18) son comunes en lesiones premalignas y 20 malignas del epitelio escamoso cervical (véase Crum et al., “Human papillomavirus infection and cervical neoplasia: New perspectives,” 1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs. 376-388; zur Hausen, Genital Papillomavirus Infections, 1985, págs. 83-90; Rigby et al., Viruses and Cancer, Cambridge University Press, Cambridge, UK; y Koutsky et al., “Epidemiology of genital human papillomavirus infection,” 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10, págs. 122-163).
Sin embargo, las dificultades en la propagación del HPV in vitro ha conducido al desarrollo de estrategias 25 alternativas para la producción de antígenos para estudios inmunológicos. Por ejemplo, Bonnez et al., “The PstI-XhoII restriction fragment of the HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and controls,” 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series, vol. 124, págs. 77-80; Jenison et al., “Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion proteins,” 1988, J. Virol., vol. 62, págs. 2115-2123; Li et al., “Identification of the human papillomavirus type 6b L1 open 30 reading frame protein in condylomas and corresponding antibodies in human sera,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 2684-2690; Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398; and Strike et al., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the 'common antigen,” 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, han expresado secuencias codificantes de proteína 35 de cápside recombinante en sistemas procariotas y usado las mismas en análisis de transferencia de Western de sueros obtenidos de individuos con infección de HPV del tracto genital. Los resultados de estos estudios han sugerido que los anticuerpos para epítopos desnaturalizados, es decir lineales de proteínas de cápside de HPV se pueden detectar en los sueros de algunos individuos infectados.
Las partículas de virus completo también se han usado para detectar anticuerpos en sueros humanos, 40 incluyendo anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Estos estudios han sido difíciles de realizar debido a que la mayoría de las lesiones inducidas por HPV que tiene origen natural producen pocas partículas. Sin embargo, las partículas de virus completas se pueden obtener en cantidades suficientes para realizar ensayos inmunológicos de verrugas plantares inducidas por HPV de tipo 1 (Kienzler et al., “Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts,” 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 65-672; “Pfister et al., 45 Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1) infections,” 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs. 161-165; y Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398) y xenoinjertos de ratón actínico de HPV-11 inducido experimentalmente (Kreider et al., “Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; y Kreider et al., “Morphological transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus from 50 condylomata acuminata,” 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641). Más particularmente, la Patente de Estados Nº 5.071.757 de Kreider et al., describe un método de propagación de viriones de HPV-11 infecciosos en el laboratorio usando un sistema de modelo de xenoinjerto de ratón atímico. Aunque este sistema es capaz de producir cantidades de virus infecciosos que se podrían usar para el desarrollo de un ensayo serológico para la infección por HPV genital, este sistema es muy costoso y engorroso. Además, hasta ahora solamente un tipo de HPV genital se ha propagado en ese 55 sistema, por tanto, limitando su utilidad. Además, el virus infeccioso producido usando este sistema representa un riesgo biológico y, por lo tanto, sería difícil de usar una formulación de vacuna.
Zhou et al., en “Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles”, 1992, Virology, vol. 185, págs. 251-257, han descrito la formación de partículas de tipo virus de HPV-16 en núcleos de células CV-1 después de la infección por un vector de expresión 60
recombinante doble de L1/L2 de HPV-16 de virus vaccinia. Sin embargo, los autores no fueron capaces de producir las VLP con un vector que exprese solamente L1. Además, las VLP producidas carecían de una simetría bien definida y eran más viables en tamaño y menores, solamente de aproximadamente 35-40 nm de diámetro que los viriones de HPV (55 nm) o las VLP de la presente invención (las VLP de HPV-11 producidas por baculovirus, de aproximadamente 50 nm de diámetro. 5
La Patente de Estados Unidos Nº 5.045.447, de Minson, describe un método de exploración de sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos monoclonales con especificidades deseadas. El método de Minson se ilustra mediante la producción de anticuerpos para la proteína L1 del papilomavirus de tipo 16 (HPV-16) usando esta proteína como el antígeno diana en ratones. Sin embrago, Minson no consigue describir la expresión de la proteína L1 o la producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV. 10
La Patente de Estados Unidos Nº 4.777.239, de Schoolnik et al., describe secuencias peptídicas cortas obtenidas de varias de las fases de lectura abierta de la región temprana de papilomavirus que provocan anticuerpos específicos de tipo para papilomavirus. Sin embargo, los inventores no consiguen describir ninguna secuencia dirigida a la fase de lectura abierta tardía principal L1.
La Patente de Estados Unidos Nº 5.057.411 de Lancaster et al., describe una secuencia polinucleotídica de 15 aproximadamente 30 nucleótidos de la fase de lectura abierta de la proteína de cápside L1 de papilomavirus que los inventores afirman que codifica un epítopo específico de tipo de papilomavirus. Sin embargo, los inventores no describen animales infectados que produzcan anticuerpos que reconozcan esta secuencia. En lugar de esto, sintetizaron una versión de papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1) de la secuencia (un péptido de 10 aminoácidos o decapéptido), después inmunizaron conejos y ensayaron la capacidad del antisuero de reaccionar con tejido de 20 fibropapiloma inducido con BPV-1 o BPV-2. El antisuero peptídico reaccionó solamente con tejido de BPV-1 y no BPV-2. Después, los inventores...
Reivindicaciones:
1. Una partícula o capsómero tipo virus del papiloma virus humano recombinante purificada que comprende una proteína cápsida del papiloma virus L1 humano tipo genital expresada a partir de una secuencia codificadora de proteína L1, la cual produce una proteína o complejo de proteínas que posee características inmunológicas y morfológicas similares a aquéllas de los papilomavirus naturales, en la que dicha partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros humanos de personas que se conoce están infectadas con virus homólogos.
2. Una partícula tipo virus según la reivindicación 1 la cual tiene un diámetro coherente con el diámetro de los viriones aislados del papilomavirus.
3. Una partícula o capsómero tipo virus según las reivindicaciones 1 ó 2 en la que dicha secuencia codificadora de la proteína L1 es expresada en una célula usando un sistema de expresión de baculovirus.
4. Una partícula o capsómero tipo virus según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en la que el papiloma virus humano de tipo genital es un papiloma humano de tipo cáncer genital.
5. Una partícula o capsómero de tipo virus según la reivindicación 4 donde el papiloma humano es uno cualquiera de HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 y HPV-35.
6. Una partícula o capsómero tipo virus según la reivindicación 5 donde el papiloma humano es HPV-18.
7. Una partícula o capsómero tipo virus según cualquiera de las reivindicaciones anteriores consistente en una proteína cápsida L1.
8. Una partícula o capsómero tipo virus de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso como una vacuna.
9. Una vacuna que consta de una partícula o capsómero tipo virus de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. Una vacuna según la reivindicación 9 la cual es una vacuna multivalente que consta de una partícula o capsómero tipo virus de diferentes virus de papiloma humano.
11. Una vacuna según las reivindicaciones 9 ó 10 que comprende adicionalmente un adyuvante.
12. El uso de una partícula o capsómero tipo virus según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 en la elaboración de una vacuna para conferir sea una protección inmune contra el virus del papiloma humano o, si el paciente esta ya infectado, para aumentar la respuesta autoinmune del paciente.
13. Un método de producción de una partícula o capsómero tipo virus según la reivindicación 1 el método que consta de una célula transfectadora con un vector de expresión recombinante que contiene una secuencia codificadora de proteína cápsida HPV L1 de tipo genital en condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína cápsida, de ese modo produciendo dichas partículas o capsómeros de tipo virus.
14. Un método según la reivindicación 13 donde el vector de expresión recombinante es un sistema de expresión de baculovirus.
15. Un método según la reivindicación 14 donde la célula es una célula de insecto.
16. Un método según la reivindicación 15, donde dicha transfección es llevada a cabo por infección.
17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, el método que comprende:
clonar una secuencia codificadora de proteína cápsida HPV L1 de tipo genital en un vector de transferencia de baculovirus;
contransfectar células de insectos con dicho vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico del virus de polihedrosis nuclear Autographa californica;
recuperar baculovirus recombinantes; e
infectar células de insectos con dicho baculovirus recombinante en condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína, produciendo de ese modo partículas tipo virus.
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