Una partícula o capsómero tipo virus del papiloma virus humano recombinante purificada que comprende una proteína cápsida del papiloma virus L1 humano tipo genital expresada a partir de una secuencia codificadora de proteína L1,

la cual produce una proteína o complejo de proteínas que posee características inmunológicas y morfológicas similares a aquéllas de los papilomavirus naturales, en la que dicha partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros humanos de personas que se conoce están infectadas con virus homólogos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de forma general al papilomavirus (PV). La descripción describe un método de expresar la secuencia codificante de proteína de cápside de papilomavirus humano de tipo 6 (HPV-6) y de tipo 11 (HPV-5 11) usando el sistema de expresión en baculovirus, producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV y el uso de estas VLP en la producción de anticuerpos que reconocen epítopos en HPV y para el desarrollo de la vacuna de HPV y para el desarrollo de ensayos serológicos para la detección de la infección por HPV, pero los mismos no forman parte de la invención como tal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

La familia Papovaviridae constituye un grupo de virus de ADN que inducen tanto infecciones líticas como tumores benignos o malignos. Estructuralmente, todos son viriones icosaédricos desnudos con 72 capsómeros y contienen ADN circular bicatenario. Los virus incluidos en la familia son: (1) papilomavirus humanos y animales, (2) poliomavirus de ratón, (3) virus vacuolantes de simio y (4) virus BK y JC humanos.

Los papilomavirus humanos (HPV) infectan epitelios cutáneo, genital, oral y respiratorio de un modo específico 15 de tejido. La infección por HPV se ha asociado estrechamente con el desarrollo tanto de lesiones benignas como de neoplasias malignas (Reichman et al., Papillomaviruses, 1990, págs. 1191-1200; y Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3ª Edición, Churchill Livingstone, New York, N.Y.). Por ejemplo, el HPV de tipo 1 (HPV-1) está presente en verrugas plantares, los HPV de tipo 6 u 11 (HPV-6 o HPV-11) en condylomata acuminata (verrugas anogenitales), mientras que el HPV de tips 16 ó 18 (HPV-16 ó HPV-18) son comunes en lesiones premalignas y 20 malignas del epitelio escamoso cervical (véase Crum et al., “Human papillomavirus infection and cervical neoplasia: New perspectives,” 1984, Int. J. Gynecol. Pathol., vol. 3, págs. 376-388; zur Hausen, Genital Papillomavirus Infections, 1985, págs. 83-90; Rigby et al., Viruses and Cancer, Cambridge University Press, Cambridge, UK; y Koutsky et al., “Epidemiology of genital human papillomavirus infection,” 1988, Epidemiol. Rev., vol. 10, págs. 122-163).

Sin embargo, las dificultades en la propagación del HPV in vitro ha conducido al desarrollo de estrategias 25 alternativas para la producción de antígenos para estudios inmunológicos. Por ejemplo, Bonnez et al., “The PstI-XhoII restriction fragment of the HPV-6b L1 ORF lacks immunological specificity as determined by sera from HPV 6 condyloma acuminatum patients and controls,” 1990, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol., New Series, vol. 124, págs. 77-80; Jenison et al., “Identification of immunoreactive antigens of human papillomavirus type 6b by using Escherichia coli-expressed fusion proteins,” 1988, J. Virol., vol. 62, págs. 2115-2123; Li et al., “Identification of the human papillomavirus type 6b L1 open 30 reading frame protein in condylomas and corresponding antibodies in human sera,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 2684-2690; Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398; and Strike et al., “Expression in Escherichia coli of seven DNA segments comprising the complete L1 and L2 open reading frames of human papillomavirus type 6b and the location of the 'common antigen,” 1989, J. Gen. Virol., vol. 70, págs. 543-555, han expresado secuencias codificantes de proteína 35 de cápside recombinante en sistemas procariotas y usado las mismas en análisis de transferencia de Western de sueros obtenidos de individuos con infección de HPV del tracto genital. Los resultados de estos estudios han sugerido que los anticuerpos para epítopos desnaturalizados, es decir lineales de proteínas de cápside de HPV se pueden detectar en los sueros de algunos individuos infectados.

Las partículas de virus completo también se han usado para detectar anticuerpos en sueros humanos, 40 incluyendo anticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Estos estudios han sido difíciles de realizar debido a que la mayoría de las lesiones inducidas por HPV que tiene origen natural producen pocas partículas. Sin embargo, las partículas de virus completas se pueden obtener en cantidades suficientes para realizar ensayos inmunológicos de verrugas plantares inducidas por HPV de tipo 1 (Kienzler et al., “Humoral and cell-mediated immunity to human papillomavirus type 1 (HPV-1) in human warts,” 1983, Br. J. Dermatol., vol. 108, págs. 65-672; “Pfister et al., 45 Seroepidemiological studies of human papilloma virus (HPV-1) infections,” 1978, Int. J. Cancer, vol. 21, págs. 161-165; y Steele et al., “Humoral assays of human sera to disrupted and nondisrupted epitopes of human papillomavirus type 1,” 1990, Virology, vol. 174, págs. 388-398) y xenoinjertos de ratón actínico de HPV-11 inducido experimentalmente (Kreider et al., “Laboratory production in vivo of infectious human papillomavirus type 11,” 1987, J. Virol., vol. 61, págs. 590-593; y Kreider et al., “Morphological transformation in vivo of human uterine cervix with papillomavirus from 50 condylomata acuminata,” 1985, Nature, vol. 317, págs. 639-641). Más particularmente, la Patente de Estados Nº 5.071.757 de Kreider et al., describe un método de propagación de viriones de HPV-11 infecciosos en el laboratorio usando un sistema de modelo de xenoinjerto de ratón atímico. Aunque este sistema es capaz de producir cantidades de virus infecciosos que se podrían usar para el desarrollo de un ensayo serológico para la infección por HPV genital, este sistema es muy costoso y engorroso. Además, hasta ahora solamente un tipo de HPV genital se ha propagado en ese 55 sistema, por tanto, limitando su utilidad. Además, el virus infeccioso producido usando este sistema representa un riesgo biológico y, por lo tanto, sería difícil de usar una formulación de vacuna.

Zhou et al., en “Expression of vaccinia recombinant HPV 16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles”, 1992, Virology, vol. 185, págs. 251-257, han descrito la formación de partículas de tipo virus de HPV-16 en núcleos de células CV-1 después de la infección por un vector de expresión 60

recombinante doble de L1/L2 de HPV-16 de virus vaccinia. Sin embargo, los autores no fueron capaces de producir las VLP con un vector que exprese solamente L1. Además, las VLP producidas carecían de una simetría bien definida y eran más viables en tamaño y menores, solamente de aproximadamente 35-40 nm de diámetro que los viriones de HPV (55 nm) o las VLP de la presente invención (las VLP de HPV-11 producidas por baculovirus, de aproximadamente 50 nm de diámetro. 5

La Patente de Estados Unidos Nº 5.045.447, de Minson, describe un método de exploración de sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos monoclonales con especificidades deseadas. El método de Minson se ilustra mediante la producción de anticuerpos para la proteína L1 del papilomavirus de tipo 16 (HPV-16) usando esta proteína como el antígeno diana en ratones. Sin embrago, Minson no consigue describir la expresión de la proteína L1 o la producción de partículas de tipo virus (VLP) de HPV. 10

La Patente de Estados Unidos Nº 4.777.239, de Schoolnik et al., describe secuencias peptídicas cortas obtenidas de varias de las fases de lectura abierta de la región temprana de papilomavirus que provocan anticuerpos específicos de tipo para papilomavirus. Sin embargo, los inventores no consiguen describir ninguna secuencia dirigida a la fase de lectura abierta tardía principal L1.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.057.411 de Lancaster et al., describe una secuencia polinucleotídica de 15 aproximadamente 30 nucleótidos de la fase de lectura abierta de la proteína de cápside L1 de papilomavirus que los inventores afirman que codifica un epítopo específico de tipo de papilomavirus. Sin embargo, los inventores no describen animales infectados que produzcan anticuerpos que reconozcan esta secuencia. En lugar de esto, sintetizaron una versión de papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1) de la secuencia (un péptido de 10 aminoácidos o decapéptido), después inmunizaron conejos y ensayaron la capacidad del antisuero de reaccionar con tejido de 20 fibropapiloma inducido con BPV-1 o BPV-2. El antisuero peptídico reaccionó solamente con tejido de BPV-1 y no BPV-2. Después, los inventores...

1. Una partícula o capsómero tipo virus del papiloma virus humano recombinante purificada que comprende una proteína cápsida del papiloma virus L1 humano tipo genital expresada a partir de una secuencia codificadora de proteína L1, la cual produce una proteína o complejo de proteínas que posee características inmunológicas y morfológicas similares a aquéllas de los papilomavirus naturales, en la que dicha partícula o capsómero es capaz de reconocer anticuerpos en sueros humanos de personas que se conoce están infectadas con virus homólogos.

2. Una partícula tipo virus según la reivindicación 1 la cual tiene un diámetro coherente con el diámetro de los viriones aislados del papilomavirus.

3. Una partícula o capsómero tipo virus según las reivindicaciones 1 ó 2 en la que dicha secuencia codificadora de la proteína L1 es expresada en una célula usando un sistema de expresión de baculovirus.

4. Una partícula o capsómero tipo virus según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en la que el papiloma virus humano de tipo genital es un papiloma humano de tipo cáncer genital.

5. Una partícula o capsómero de tipo virus según la reivindicación 4 donde el papiloma humano es uno cualquiera de HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 y HPV-35.

6. Una partícula o capsómero tipo virus según la reivindicación 5 donde el papiloma humano es HPV-18.

7. Una partícula o capsómero tipo virus según cualquiera de las reivindicaciones anteriores consistente en una proteína cápsida L1.

8. Una partícula o capsómero tipo virus de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso como una vacuna.

9. Una vacuna que consta de una partícula o capsómero tipo virus de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Una vacuna según la reivindicación 9 la cual es una vacuna multivalente que consta de una partícula o capsómero tipo virus de diferentes virus de papiloma humano.

11. Una vacuna según las reivindicaciones 9 ó 10 que comprende adicionalmente un adyuvante.

12. El uso de una partícula o capsómero tipo virus según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 en la elaboración de una vacuna para conferir sea una protección inmune contra el virus del papiloma humano o, si el paciente esta ya infectado, para aumentar la respuesta autoinmune del paciente.

13. Un método de producción de una partícula o capsómero tipo virus según la reivindicación 1 el método que consta de una célula transfectadora con un vector de expresión recombinante que contiene una secuencia codificadora de proteína cápsida HPV L1 de tipo genital en condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína cápsida, de ese modo produciendo dichas partículas o capsómeros de tipo virus.

14. Un método según la reivindicación 13 donde el vector de expresión recombinante es un sistema de expresión de baculovirus.

15. Un método según la reivindicación 14 donde la célula es una célula de insecto.

16. Un método según la reivindicación 15, donde dicha transfección es llevada a cabo por infección.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, el método que comprende:

clonar una secuencia codificadora de proteína cápsida HPV L1 de tipo genital en un vector de transferencia de baculovirus;

contransfectar células de insectos con dicho vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico del virus de polihedrosis nuclear Autographa californica;

recuperar baculovirus recombinantes; e

infectar células de insectos con dicho baculovirus recombinante en condiciones que faciliten la expresión de dicha proteína, produciendo de ese modo partículas tipo virus.